Одновременный<em> Экс естественных условиях</em> Функциональное тестирование двух сетчатки по<em> В естественных условиях</em> Система электроретинограммы
Summary
Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.
Abstract
An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.
Introduction
Электроретинограмму (ЭРГ) является хорошо отработанной технологией, которая может использоваться для записи электрической активности сетчатки, вызванного светом. Сигнал ЭРГ генерируется в основном изменения напряжения, вызванных радиальных токов (вдоль оси фоторецепторов и биполярных клеток), протекающей в резистивном внеклеточном пространстве сетчатки. Первый сигнал ЭРГ был записан в 1865 году Холмгреном от поверхности рыбий глаз 1. Эйнтховен и Джолли 1908 2 делится ответ ERG в начале света в трех различных волн, называемых А-, B- и С-волн, которые в настоящее время, как известно, отражает главным образом деятельность фоторецепторов, ПО биполярных клеток и пигментного эпителия Клетки, соответственно 3-8. ЭРГ может быть записан от глаз под наркозом животных или человека (в естественных условиях), с изолированной подготовки глаз 9, по изолированной неповрежденной сетчатки (экс естественных условиях) 3,10-15 или через определенные слои сетчатки с микроэлектродов (местноеЭРГ) 4,16. Из них в естественных условиях ЭРГ в настоящее время наиболее широко используемый метод для оценки функции сетчатки. Это неинвазивный метод, который может быть использован в целях диагностики или следовать прогрессирование заболеваний сетчатки у животных или пациентов. Тем не менее, в естественных условиях ERG записи производят сложную сигнал с нескольких перекрывающихся компонентов, часто загрязнены экстраокулярной физиологического шума (например, дыхания и сердечной деятельности).
Местное ЭРГ может быть использован для записи сигнала через конкретных слоев сетчатки, но это наиболее инвазивная и имеет самый низкий сигнал-шум (SNR) по сравнению с другими конфигурациями записи ЭРГ. Местное ЭРГ также технически сложных и требует дорогостоящего оборудования (например, микроскопа и Микроманипуляторы). Transretinal ЭРГ от неповрежденной, изолированные сетчатки (экс естественных ЭРГ) предлагает компромисс между в естественных условиях и местных методов ЭРГ позволяет стабильно и HIGч SNR записи из неповрежденных сетчатки животных и человека. 17 В последнее время этот метод был успешно использован для изучения функции палочек и колбочек фоторецепторов в млекопитающих, приматов и человека сетчатки 18-20. Кроме того, из-за отсутствия пигментного эпителия в сетчатку экс естественных условиях, положительно компонент с волны сигнала ERG удаляется и ярко выраженными негативными медленная компонента PIII раскрывается в Экс Vivo записей. Медленная компонента PIII было показано, происходят из деятельности Клетки Мюллера клеток в сетчатке 21-23. Таким образом, экс виво метод ЭРГ также может быть использован для изучения Мюллера клеток в интактной сетчатке. Несколько исследований также показали, что экс естественных условиях ERG записи может быть использован для измерения концентрации фармакологических агентов по сетчатке 24 и проверить безопасность и эффективность препаратов 25-27.
Несколько коммерческих систем в естественных условиях имеются ииспользуется во многих лабораториях, которые не обязательно имеют большой фон электрофизиологии. В отличие от экс естественных устройства не не были доступны до недавнего 17, и в результате только очень немногие лаборатории в настоящее время воспользоваться этой мощной техники. Это было бы выгодно, чтобы экс естественных ERG записи доступны более лабораториями в целях продвижения наши знания о сетчатки физиологии и патологии, а также разработать новые методы лечения для ослепления заболеваний. Покажем здесь простое и доступное экс виво ERG устройство 17 и показать, как оно может быть использовано в сочетании с несколькими коммерчески доступных систем в естественных условиях ЭРГ записывать rod- и конуса-опосредованной передачи сигналов (А- и В-волны) и функция Müller клеток (замедлить PIII) из неповрежденных сетчатки мыши дикого типа.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы демонстрируем здесь важные шаги для получения высококачественных экс естественных ERG записи одновременно с двумя изолированными сетчатки мыши с помощью компонентов в естественных условиях системы ЭРГ вместе с экс естественных ERG адаптера. В этом исследовании мы ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана NIH гранты EY019312 и EY021126 (VJK), EY002687 в Департамент офтальмологии и визуальных наук в Университете Вашингтона, и исследований, чтобы предотвратить слепоту.
Materials
| In vivo ERG system | OcuScience | HMsERG | www.ocuscience.us/id77.html |
| In vivo ERG system | LKC Technologies | UTAS-E 3000 | www.lkc.com/products/UTAS/bigshot.html |
| Ex vivo adapter | OcuScience | Ex VIVO ERG adapter | www.ocuscience.us/id107.html |
| Dissection microscope | North Central Instruments | Leica M80 | May use any brand |
| IR emitter | Opto Diode Corp. | OD-50L | www.optodiode.com |
| Prowler Night Vision Scopes | B.E. Meyers Electro Optics | D4300-I | Military grade product. |
| Red filter | Rosco Laboratories | Roscolux #27 Medium Red | May be used instead of IR system |
| Red head light | OcuScience | ERGX011 | www.ocuscience.us/catalog/i29.html |
| Microscissors | WPI, Inc. | 500086 | www.wpiinc.com/ |
| Dumont tweezers #5 | WPI, Inc. | 14101 | |
| Razor blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | www.emsdiasum.com |
| Scale | Metler Toledo | AB54-S/FACT | May use any brand |
| pH meter and electrode | Beckman Coulter | pHI 350 | May use any brand |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | May use any brand |
| KCl | Sigma-Aldrich | 60129 | May use any brand |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 63020 | 1.0 M solution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21114 | 1.0 M solution |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 431788 | May use any brand |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | May use any brand |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | May use any brand |
| Ames medium | Sigma-Aldrich | A1420 | May use any brand |
| BaCl2 | Sigma-Aldrich | B0750 | May use any brand |
| DL-AP4 | Tocris Bioscience | 101 | May use any brand |
| Succinic acid disodium salt | Sigma-Aldrich | 224731 | May use any brand |
| L-Glutamic acid | Sigma-Aldrich | G2834 | May use any brand |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | May use any brand |
| Leibovitz culture medium L-15 | Sigma-Aldrich | L4386 | May use any brand |
| MEM vitamins | Sigma-Aldrich | M6895 | |
| MEM amino acids | Sigma-Aldrich | M5550 | |
| Carbogen | Airgas | UN3156 | 5% CO2 |
References
- Armington, J. C. . The Electroretinogram. , (1974).
- Einthoven, W., Jolly, W. A. The form and magnitude of the electrical response of the eye to stimulation by light at various intensities. Q J Exp Physiol. 1, 43 (1908).
- Granit, R. The components of the retinal action potential in mammals and their relation to the discharge in the optic nerve. J. Physiol. 77, 207-239 (1933).
- Penn, R. D., Hagins, W. A. Signal transmission along retinal rods and the origin of the electroretinographic a-wave. Nature. 223, 201-204 (1969).
- Stockton, R. A., Slaughter, M. M. B-wave of the electroretinogram. A reflection of ON bipolar cell activity. J. Gen. Physiol. 93, 101-122 (1989).
- Robson, J. G., Frishman, L. J. Response linearity and kinetics of the cat retina: the bipolar cell component of the dark-adapted electroretinogram. Vis. Neurosci. 12, 837-850 (1995).
- Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. A dissection of the electroretinogram from the isolated rat retina with microelectrodes and drugs. Vis. Neurosci. 16, 727-741 (1999).
- Steinberg, R. H., Schmidt, R., Brown, K. T. Intracellular responses to light from cat pigment epithelium: origin of the electroretinogram c-wave. Nature. 227, 728-730 (1970).
- Wilson, W. S., Shahidullah, M., Millar, C. The bovine arterially-perfused eye: an in vitro method for the study of drug mechanisms on IOP, aqueous humour formation and uveal vasculature. Curr. Eye Res. 12, 609-620 (1993).
- Frank, R. N., Dowling, J. E. Rhodopsin photoproducts: effects on electroretinogram sensitivity in isolated perfused rat retina. Science. 161, 487-489 (1968).
- Donner, K., Hemila, S., Koskelainen, A. Temperature-dependence of rod photoresponses from the aspartate-treated retina of the frog (Rana temporaria). Acta Physiol. Scand. 134, 535-541 (1988).
- Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. Electrophysiological properties of a new isolated rat retina preparation. Vision Res. 39, 2165-2177 (1999).
- Hamasaki, D. I. The effect of sodium ion concentration on the electroretinogram of the isolated retina of the frog. J. Physiol. 167, 156-168 (1963).
- Luke, M., et al. The isolated perfused bovine retina–a sensitive tool for pharmacological research on retinal function. Brain Res. Brain Res. Protoc. 16, 27-36 (2005).
- Bastian, B. L., Fain, G. L. Light adaptation in toad rods: requirement for an internal messenger which is not calcium. J. Physiol. 297, 493-520 (1979).
- Arden, G. B. Voltage gradients across the receptor layer of the isolated rat retina. J. Physiol. 256, 333-360 (1976).
- Vinberg, F., Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. Ex vivo ERG analysis of photoreceptors using an in vivo ERG system. Vision Res. 101, 108-117 (2014).
- Nymark, S., Heikkinen, H., Haldin, C., Donner, K., Koskelainen, A. Light responses and light adaptation in rat retinal rods at different temperatures. J. Physiol. 567, 923-938 (2005).
- Heikkinen, H., Nymark, S., Koskelainen, A. Mouse cone photoresponses obtained with electroretinogram from the isolated retina. Vision Res. 48, 264-272 (2008).
- Wang, J. S., Kefalov, V. J. An alternative pathway mediates the mouse and human cone visual cycle. Curr. Biol. 19, 1665-1669 (2009).
- Bolnick, D. A., Walter, A. E., Sillman, A. J. Barium suppresses slow PIII in perfused bullfrog retina. Vision Res. 19, 1117-1119 (1979).
- Newman, E. A. Potassium conductance block by barium in amphibian Muller cells. Brain Res. 498, 308-314 (1989).
- Oakley, B., Katz, B. J., Xu, Z., Zheng, J. Spatial buffering of extracellular potassium by Muller (glial) cells in the toad retina. Exp. Eye Res. 55, 539-550 (1992).
- Nymark, S., Haldin, C., Tenhu, H., Koskelainen, A. A new method for measuring free drug concentration: retinal tissue as a biosensor. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 47, 2583-2588 (2006).
- Walter, P., Luke, C., Sickel, W. Antibiotics and light responses in superfused bovine retina. Cell. Mol. Neurobiol. 19, 87-92 (1999).
- Luke, M., et al. The safety profile of alkylphosphocholines in the model of the isolated perfused vertebrate retina. Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 248, 511-518 (2010).
- Januschowski, K., et al. Electrophysiological toxicity testing of VEGF Trap-Eye in an isolated perfused vertebrate retina organ culture model. Acta Ophthalmol. 92, e305-e311 (2014).
- Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. Transretinal ERG recordings from mouse retina: rod and cone photoresponses. J Vis Exp. , (2012).
- Koskelainen, A., Hemila, S., Donner, K. Spectral sensitivities of short- and long-wavelength sensitive cone mechanisms in the frog retina. Acta Physiol. Scand. 152, 115-124 (1994).
- Lyubarsky, A. L., Falsini, B., Pennesi, M. E., Valentini, P., Pugh, E. N. UV- and midwave-sensitive cone-driven retinal responses of the mouse: a possible phenotype for coexpression of cone photopigments. J. Neurosci. 19, 442-455 (1999).
- Lyubarsky, A. L., Daniele, L. L., Pugh, E. N. From candelas to photoisomerizations in the mouse eye by rhodopsin bleaching in situ and the light-rearing dependence of the major components of the mouse ERG. Vision Res. 44, 3235-3251 (2004).
- Azevedo, A. W., Rieke, F. Experimental protocols alter phototransduction: the implications for retinal processing at visual threshold. J. Neurosci. 31, 3670-3682 (2011).
- Carter-Dawson, L. D., LaVail, M. M. Rods and cones in the mouse retina. I. Structural analysis using light and electron microscopy. J. Comp. Neurol. 188, 245-262 (1979).
- Fain, G. L., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Koutalos, Y. Adaptation in vertebrate photoreceptors. Physiol. Rev. 81, 117-151 (2001).
- Calvert, P. D., Strissel, K. J., Schiesser, W. E., Pugh, E. N., Arshavsky, V. Y. Light-driven translocation of signaling proteins in vertebrate photoreceptors. Trends Cell Biol. 16, 560-568 (2006).
- Schneeweis, D. M., Schnapf, J. L. The photovoltage of macaque cone photoreceptors: adaptation, noise, and kinetics. J. Neurosci. 19, 1203-1216 (1999).
- Heikkinen, H., Vinberg, F., Nymark, S., Koskelainen, A. Mesopic background lights enhance dark-adapted cone ERG flash responses in the intact mouse retina: a possible role for gap junctional decoupling. J. Neurophysiol. 105, 2309-2318 (2011).
- Gouras, P., MacKay, C. J. Growth in amplitude of the human cone electroretinogram with light adaptation. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 30, 625-630 (1989).
- Peachey, N. S., Goto, Y., al-Ubaidi, M. R., Naash, M. I. Properties of the mouse cone-mediated electroretinogram during light adaptation. Neurosci. Lett. 162, 9-11 (1993).
