JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
русский

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Применение Долгосрочный культивируют Интерферон-γ фермент-связанного Immunospot анализе для оценки эффекторных и памяти T-клеточные ответы у крупного рогатого скота

Published: July 11, 2015
doi:
10.3791/52833
, , , , , ,
1Infectious Bacterial Diseases Research Unit, National Animal Disease Center, Agricultural Research Service,United States Department of Agriculture, 2Department of Veterinary Pathology, College of Veterinary Medicine,Iowa State University, 3UK Veterinary Laboratories Agency, 4Visual Services, National Centers for Animal Health, Animal and Plant Health Inspection Service,United States Department of Agriculture

Summary

Долгосрочный культивируют интерферона-γ связанный с ферментом immunospot анализ используют в качестве меры центральных ответов памяти и коррелирует с защитных анти-микобактериальных ответов вакцин. С этого анализа, мононуклеарные клетки периферической крови стимулируют микобактериальных антигенов и интерлейкина-2 в течение 14 дней, что позволяет дифференциации и расширения центральных Т-клеток памяти.

Abstract

Эффекторные и Т-клеток памяти создаются путем программирования развития наивных клеток после признания антигенов. Если инфекция контролируется до 95% Т-клеток, полученных на стадии расширения исключаются (т.е.., Фаза сжатия) и Т-клеток памяти остаются, иногда на всю жизнь. В организме человека, два функционально различных подмножества Т-клеток памяти были описаны на основе выражения лимфатических узлов наведения рецепторов. Центральный Т-клетки памяти выразить CC хемокинов рецептор 7 и CD45RO и расположены в основном в Т-клеточных зонах вторичных лимфоидных органов. Эффектор Т-клетки памяти выразить CD45RO, не хватает CCR7 и отображения рецепторы, связанные с наведением лимфоцитов периферических или воспаленных тканей. Эффекторные Т-клетки не выражают ни CCR7 или CD45RO но при встрече с антигеном производят эффекторных цитокинов, таких как интерферон-γ. Интерферон-γ высвобождением анализы используются для диагностики бычьего и человеческого туберкулеза иобнаружить в первую очередь эффектор эффектор и памяти Т-клеточные ответы. Клеточные ответы центральной памяти T CD4 + Т-клеток до вакцинации, а с другой стороны, может быть использован для прогнозирования эффективности вакцины, как показано вирусом иммунодефицита обезьян инфекции приматов, туберкулеза у мышей и малярии у человека. Несколько исследований на мышах и людях, а также неопубликованные данные о крупного рогатого скота, показали, что интерферон-γ ELISPOT анализы измерения центральной памяти Т-клеточные ответы. С этого анализа, мононуклеарных клеток периферической крови культивируют в уменьшении концентрации антигена для 10 до 14 дней (долгосрочная культура), что позволяет ответы эффекторные пик и уменьшаться; содействия центральных Т-клеток памяти, чтобы дифференцировать и расширить в культуре.

Introduction

Эффекторные и Т-клеток памяти создаются путем программирования развития наивных CD4 + Т-клеток после распознавания антигена. Дифференцировки наивных CD4 + Т-клеток в цитокинов клеток, продуцирующих требует признания патогена врожденных иммунных клеток, антигена Т-клеток, со-стимуляции и транскрипционные изменения в результате в поляризованном продукции цитокинов. Например: антиген-представляющих клеток продуцируют интерлейкин (IL) -12 в ответ на внутриклеточных патогенов, которые вместе с распознавание антигена, способствует дифференцировке Т-клеток в Т-хелперов 1 (Th1) клеток 1,2 с помощью передачи сигналов через преобразователь сигнала и активатор транскрипции 4 (STAT4) и Т-поле выражается в Т-клеток (Т-БЭТ), что приводит к активации клеток, IL-2, производства клональной экспансии и интерферона (ИФН) -γ производства 3,4. Если инфекция контролируется до 95% Т-клеток, полученных на стадии расширения исключаются (т.е. сужениефаза) и Т-клеток памяти остаются, иногда на всю жизнь 5. Sallusto др. 6, были выявлены два функционально различных подмножества Т-клеток памяти в организме человека на основе выражения лимфатических узлов самонаведения рецепторов. Центральные Т-клеток памяти (TCM) выражают CC хемокинов рецептор (CCR) -7 и CD45RO и расположены в основном в Т-клеточных зонах вторичных лимфоидных органов. Tcm ограничены эффекторной функции, низким порогом активации и сохраняют высокую интерлейкина-2 и пролиферативную способность. Эффектор Т-клеток памяти (ТЕА) выражают CD45RO, не хватает CCR7 и отображения рецепторы самонаведения периферийных или воспаленных тканей. Эффекторные клетки не экспрессируют либо CCR7 или CD45RO но оперативно производить эффекторные цитокины, такие как IFN-γ, при распознавании антигена.

ИФН-γ релиз анализы (Игра) используются для диагностики крупного рогатого скота и человека туберкулезом 7. Mycobacterium Бови является основным агентом туберкулеза крупного рогатого скота (BTB), а человека окSES туберкулеза вызваны, главным образом, микобактерий туберкулеза. С помощью этих тестов, цельной крови или мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) стимулировали микобактериальных антигенов в течение 16 до 24 часов и производство IFN-γ в надосадочной жидкости измеряется ELISA или с помощью обнаружения клеток, продуцирующих IFN-γ с помощью ELISPOT техники. В результате краткого периода стимуляции (т.е.., От 16 до 24 ч) и быстрое производство цитокинов, исключая виво анализы обнаружить прежде эффекторные и ТЕА ответов. Это было подтверждено с помощью проточной цитометрии анализа клеточных популяций в этих культурах 8-10.

Экс Vivo IFN-γ ответы обычно включены в оценки иммунного ответа панели вакцин туберкулеза, в том числе те, которые используются для оценки ответов от крупного рогатого скота. Наиболее эффективным крупного рогатого противотуберкулезные вакцины вызывают определенные IFN-γ ответов, но не все вакцины, которые индуцируют IFN-γ ответы защитная пре. Кроме того, уровни IFN-γ, вызванной вакцинацией, как измерено до заражения, не обязательно коррелируют с защитой. Например, различные штаммы БЦЖ может иметь различную мощность, чтобы вызвать экс виво IFN-γ ответ, несмотря на том же уровне защиты 11. Таким образом, экс естественных Играсом ценны для диагностики туберкулеза и для доступа к иммуногенности вакцины; Однако их использование в качестве предикторов эффективности вакцины ограничено. Tcm ответы на вакцинацию, с другой стороны, может быть использован для прогнозирования эффективности вакцины, как показано вирусом иммунодефицита обезьян (SIV) инфекции в приматов 12,13, туберкулеза у мышей 14 и малярии у человека 15,16.

После эффективного иммунного ответа, в результате чего зазор патогена, Tcm которые поддерживают и обеспечивают защиту к возможному второй инфекции тем же самым агентом. Заметным исключением этого сценария М. туберкулез инфеие людей, в которых пациенты, получающие лечебный анти-микобактерий терапии подвержены повторной инфекции 17,18. Кроме того, события, регулирующие иммунологическую память в течение хронических инфекций, в котором антигенной стимуляции сохраняется, не очень хорошо понял, 19. Во время хронических инфекций, таких как с вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ) и туберкулеза, значительное ответ Tcm связано с благоприятным исходом (например, задержки с туберкулезом и субклинического заболевания с ВИЧ) 20,21. Несколько исследований на мышах и людях показали, что долгосрочные культурные IFN-γ ELISPOT анализы измерения TCM ответов 16,20-22. С этого анализа, РВМС культивировали в уменьшении концентрации антигена в течение 10 до 14 дней, что позволяет реакции эффекторных пик и уменьшаться; содействия Tcm дифференцировать и расширить в культуре.

Долгосрочные культивированный IFN-γ ELISPOT анализы также были использованы в ветеринарииИсследование, пока фенотип отвечающих клеток было трудно оценить из-за отсутствия критических реагентов, особенно антитела к CCR7. Эффективные бычьи противотуберкулезные вакцины [например. используя одну дозу M. Бови Кальметта Герена (БЦЖ), БЦЖ следует вирусно-векторная антиген 85А субъединицы вакцины, или ослабляется М. Бови ΔRD1] вызвать долгосрочные культурные IFN-γ ELISPOT ответы после вакцинации, которые коррелируют с защитой (т.е. ниже микобактерий бремя и снижение ТБ-сопутствующая патология) против последующего заражения вирулентным M. Бови 23,24. Кроме того, число антиген-специфических IFN-γ-секретирующие клетки в долгосрочных РВМС культур выше на 12 месяцев, но уменьшить на 24 месяцев после вакцинации БЦЖ новорожденных телят, соотнося со степенью защиты обнаруживаемого сообщению М. Бови задача 25. В этом случае, культивируют IFN-γ ELISPOT являетсяп важным инструментом для прогнозирования эффективности вакцины, предоставляя средства для приоритизации вакцин-кандидатов для высокой стоимости испытаний эффективности. Кроме того, культивируемые методы ELISPOT может быть адаптирована для различных хостов, патогенов и цитокинов путем изменения антигены или антитела для различных целей в различных областях исследований.

Protocol

1. Подготовьте следующие решения Подготовьте полное RPMI (cRMPI) добавлением фетальной бычьей сыворотки (FBS) до концентрации 10% (объем / объем), глутамин (2 мкм) пирувата натрия (1 мкМ), несущественных аминокислот (0,1 мкМ), пенициллин -streptomycin (100 единиц / мл пенициллина и 0,1 мг / мл стрептомицина) и 2-меркаптоэтанол (50 мМ) в среде RPMI 1640. Подготовьте 2 х кислый цитрат декстроза, путем смешивания цитрат натрия (77 мкМ), лимонную кислоту (38 мкм) и декстрозу (122 мкм) в дистиллированной воде. Подготовьте Са 2+ Mg 2+ фосфатный буферный солевой раствор (PBS), рН 7,2: NaCl (137 мМ), KCl (2,7 мМ), Na 2 HPO 4 (двухосновной, 10 мМ), КН 2 РО 4 (одноосновной, 2 мМ) в дистиллированной воде; доведения рН до 7,2. Готовят 1% PBS (PBS 1% BSA), добавив бычий сывороточный альбумин в PBS (объем / вес, 1G / 100 мл PBS). Подготовьте PBS + 0,05% Tween 20(PBST) с добавлением 0,05% Tween 20 в PBS (объем / объем 500 мкл Tween 20/1 л ФБР). Подготовьте 100 мМ трис-HCl, рН 8,2 буфер путем смешивания Трис (100 мм), HCl (0,50 мМ) в дистиллированной воде. Подготовка 35% -ным раствором этанола разбавлением этиловым спиртом (чистота ≥99.5%) в дистиллированной воде (объем / объем, 35 ​​мл этилового спирта / 100 мл дистиллированной воды). Фильтр стерилизуют cRPMI, 2 х кислый цитрат декстроза, PBS, PBS 1% BSA, используя 0,22 мкм фильтры. 2. Долгосрочные культивируемых клеток (День 14 протокол) (День первый) Подготовка антигена решения на удвоенной конечной концентрации в cRPMI. Антиген выбор имеет решающее значение и должны быть адаптированы к цели исследования. Развести рекомбинантный М. туберкулез антигенов TB10.4 и антиген Ag85A до 2 мкг / мл (каждого антигена; конечная концентрация 1 мкг / мл). Развести М. Бови очищенный белковый дериват(PPD-B, Prionics Ag) с 10 мкг / мл (конечная концентрация 5 мкг / мл). Развести рекомбинантный ранний секреторный антигенную цель 6 (ESAT-6) и фильтрата культуры белок 10 (CFP-10) слитого белка (Решат-6: CFP10) в 2 мкг / мл (конечная концентрация 1 мкг / мл). Примечание: Эти антигены иммунодоминантным IFN-γ индукции антигены микобактерий туберкулезного и могут быть включены, чтобы стимулировать РВМС из М. Бови инфицированных животных. БЦЖ или M. Бови ΔRD1 вакцинированы животные не реагируют на Решат-6: CFP10, как регион, кодирующей эти антигены (т.е. RD1) удаляется в этих штаммов. Решат-6: CFP10 используется в этих исследования было своего рода подарок от д-ра К. Minion, Университета штата Айова. TB10.4 и антиген Ag85A являются иммунодоминантные антигенов, присутствующих в опасной и вакцины М. Бови напрягает 37. БДПП, как очищенный белковый дериват, это комплекс из нескольких антигенов, включая антигены совместно с нетуберкулезных микобактерий. InfecТед животные потенциально реагировать на все антигены (а именно: TB10.4, Ag 85А, Решат-6: CFP10 и БДПП), в то время как вакцинированные животные не должны реагировать на Решат-6: CFP10 11. Пластина 500 мкл / лунку раствора антигена в quadruplicates для каждого животного в 24-луночный планшет. Для этого протокола, использовать антигены, как бассейн; Таким образом, использовать все лунки содержат все антигены и не контролирует (таких как, нулевым или митоген) этот шаг. Выдержите пластину на 39 ° C / 5% CO 2. Нормальная температура крупного рогатого скота 39 ° С; Таким образом, некоторые исследователи используют 39 ° C для культуры клеток крупного рогатого. Кроме того, в некоторых случаях с клетками человека, культура клеток на 39 ° C обеспечивает дополнительное преимущество 26,30. Шприцы предварительной нагрузки в сочетании с 16 или 18 г игл 6 мл 2 Х кислотно-цитрат-декстроза; и собрать 60 мл бычьей крови по яремной вены. Изолировать РВМС стандартным центрифугированием в градиенте плотности в периферической крови светлого сгустка фракцийрегулирования концентрации клеток 4 × 10 6 клеток / мл, как описано Maue др. 27 Добавить клеток (500 мкл / лунку) в антигена предварительно 24-луночного планшета, в четырех повторностях для каждого животного (этап 2.5). Выдержите пластину на 39 ° C / 5% CO 2. (Дни три и семь) Использование метода стерилизации, осторожно удалить 500 мкл супернатанта из каждой лунки, не нарушая клеточный слой. Пополнить а объем путем добавления 500 мкл / лунку cRPMI содержащий IL-2 (30 U / мкл, т.е. 15 U / лунку рекомбинантный человеческий ИЛ-2 Сигма I7908). Выдержите пластину на 39 ° C / 5% CO 2. (Дни 10 и 12) Использование стерильных, удалить 750 мкл супернатанта из каждой лунки. Пополнять объем с 750 мкл / лунку cRPMI (без IL-2). Выдержите пластину на 39 ° C / 5% CO 2. <pкласс = "jove_title"> 3. ELISPOT анализа (Три дня протокол) (Один день (12-й день протокола долгосрочного культуры)) Этикетка ELISPOT пластины должным образом для каждого набора образцов, чтобы избежать ошибок при покрытие клетки: долгосрочные клетки плюс антиген-представляющих клеток (БТР), долгосрочные клетки без БТР и бывших естественных условиях / краткосрочных клеток (рисунок 1). Репликация для каждой обработки (т.е. антигенной стимуляции) должно быть сделано, по крайней мере в двух экземплярах. Получают раствор иммобилизованным антителом мыши путем разбавления анти-бычий IFN-γ антител (MCA2112, клон CC330) в PBS (8 мкг / мл). Использование многоканальной пипетки предварительного смачивания лунки ELISPOT пластины с 15 мкл / лунку 35% этанола в течение 1 мин. Для предотвращения повреждения мембраны, не касаться дна скважины с наконечниками пипеток в любой точке во время теста. Промывают планшет шесть раз 300 мкл / лунку PBS. Промывочной жидкости должен быть отброшен инверсии пластины, Моет должно быть сделано быстро, не позволяя планшетов высохнуть. Внесите 100 мкл / лунку анти-захвата ИФН-γ антитела (со стадии 1 выше). Выдержите в 4 ° CO / N (держать пластину внутри молнии сумка для хранения). (Два дня (13-й день протокола долгосрочного культуры)) Подготовка антигена решения на удвоенной конечной концентрации. Лечение: отсутствие стимуляции (cRPMI), PPD-B (20 мкг / мл, конечная концентрация: 10 мкг / мл), коктейль из белков и TB10.4 Ag85A (2 мкг / мл каждого белка, конечная концентрация: 1 мкг / мл каждого белка), Решат-6: CFP10 (по М. Bovis инфекции, 2 мкг / мл, конечная концентрация: 1 мкг / мл) и положительного контроля, такие как Лаконос (20 мкг / мл, конечна концентраци: 10 мкг / мл). Другие митоген может быть использован вместо PWM (например, конканавалин A). ПРИМЕЧАНИЕ: для этого шага антигены составляют четыре различные процедуры и пOT используется в качестве бассейна (как на шаге 2.5). Четыре процедуры: Н.С., БДПП, протеиновый коктейль (TB10.4 и Ag85A составляют одну обработку) и ШИМ. 4. Краткосрочные Культура клеток и клеток Приверженец (БТР) Изоляция Соберите 60 мл крови от тех же животных, отводимых на 1 день (под: долгосрочного культуры, 14 протокола день) и изолировать МНПК, как раньше. Регулировка концентрации клеток 2 х 10 6 клеток / мл. Этикетка трубки ясно, чтобы предотвратить нерациональное, когда покрытие клетки. Эти клетки будут использоваться для изоляции БТР, а также как краткосрочное культуры клеток (шаг 6.5). Этикетка трубки с обоих численности животных и типа культуры (в данном случае: Экс Vivo, краткосрочной или свежие клетки). Удалите излишки антитела захвата от ELISPOT инверсией знака. Вымойте пластины 6 раз с 300 мкл PBST. Удалить столько PBST, как это возможно. Внести 50 мкл суспензии клеток в лунки помечены как долгосрочных клеток плюс АРС. Блок друга вэйLs с 200 мкл / лунку cRPMI. Выдержите 90 мин при 39 ° или C. Предварительно теплой cRPMI или 39 ° С (необходимо для последующих шагов). Свежие МНПК не используются для приверженцем клеток (БТР) изоляции будут необходимы в последующих шагов и должны быть сохранены. 5. культивируемых клеток Во время 90-минутной инкубации (шаг 4.4, краткосрочный культуры и приверженцем шаг изолятор), урожай долгосрочных культивируемых клеток. Использование 5 или 10 мкл пипетки, пипетки медиа с клетками, вверх и вниз, чтобы отделить клетки, объединить четырех экземплярах повторяет от каждого животного в одной трубе 15 мл. Центрифуга пробирки в течение 5 мин при 400 г. После центрифугирования, отбросить супернатант по инверсии трубки. Выбить осадок клеток. Добавляют 5 мл PBS, аккуратно повторно приостанавливать осадок, если это необходимо. Повторите центрифугирования. Повторите этап промывки дважды. Удалите супернатант инверсией трубки и аккуратно вновь приостановить клеток в 1 мл cRPMI. Отрегулируйте концентрацию клеток2 × 10 5 клеток / мл. 6. Покрытие Свежий и культивированный МНПК После 90 мин инкубации, встряхните пластин на шейкере в течение 30 сек. Удалить неадгезированных клеток путем инверсии пластины. Внесите 150 мкл / лунку теплой cRPMI (с шага 4, в разделе: Краткосрочные клеток и клеток приверженцем (БТР) стадии выделения). Встряхнуть пластины и выбросить моющую жидкость. Повторите мыть 3 раза. Добавить 100 мкл / лунку каждого антигена в соответствующие лунки (предварительно помечены). Для пластины клетки, пипетки 100 мкл / лунку долгосрочный культивируют клеточную суспензию (2 х 10 5 клеток / мл) в лунки помечены как долгосрочных клеток плюс БТР. Убедитесь, что долгосрочные клетки, добавленные в этом шаге от того же животного, APC уже в хорошо. Не смешивать культивируемые клетки APC и долгосрочные с разных животных. Внесите 100 мкл / лунку долгосрочной культурной клеточной суспензии (2 х 10 5 клеток / мл) в скважинах без APCс для оценки требований к APC ответ долгосрочной культуре. Добавить 100 мкл / лунку краткосрочные клетки (свежевыделенные и доводили до 2 × 10 6 клеток / мл) для экс естественных условиях оценки отклика. Выдержите пластины O / N на 39 ° C / 5% CO 2 инкубатор. Убедитесь, что пластины лежа и не укладывать плиты. Примечание: Если анализ клеточного фенотипа желательно, проточной цитометрии могут быть выполнены в виде вспомогательного анализа. Клетки высевают в 96-луночные U нижней пластины (вместо ELISPOT пластины), как описано для анализа ELISPOT. Адсорбции антител захвата (шаги 3,4 до 3,5) должна быть пропущена. Затем клетки инкубировали O / N при 39 ° C / 5% CO 2 и стандартный протокол окрашивание клеток выполняется. Окрашивания клеток реагенты, включенные в таблицу реагентов. День третий (14-й день протокола долгосрочного культуры) Развести антитела обнаружения (мыши против коровьей IFN-γ, клон CC302) 5 мкг / мл в PBS 1% BSA. Откажитесь от жидкости скважин и мыть тарелки: шесть раз ФБРТ (300 мкл / лунку), размещение на шейкере каждый раз в течение 10 сек до и в период между стирок, один раз дН 2 O (300 мкл / лунку), дополнительных 6 раз с PBST (300 мкл / лунку) и два раза с PBS (300 мкл / лунку). После клетки удаляют из планшетов, и, если никаких проблем биобезопасности не применяются, процедуры могут быть выполнены вне боксов биологической безопасности. Отменить промывочной жидкости. Удалить столько моющей жидкости, как это возможно, нажав пластину на бумажных полотенцах. Добавить антитела обнаружения (100 мкл / лунку). Планшеты инкубируют в течение 120 мин при 39 ° или C. Во время этой инкубации шаг, подготовить щелочной раствор фосфатазы в соответствии с инструкциями изготовителя. Тридцать минут перед использованием (т.е. 90 мин после добавления детектирующего антитела к скважинам) разбавить реагента в PBST. Переверните пробирку осторожно смешать реактивы и инкубировали при комнатной температуре. После 120 мин инкубации, удалите излишки антитела обнаружения инверсией знака. Промыть пластины в 6 раз с помощью PBST (300 мкл / лунку). Удалить столько моющей жидкости, как это возможно, нажав пластину на бумажных полотенцах. Добавить 100 мкл / лунку щелочной фосфатазы (решение от шаге 3 выше). Планшеты инкубируют в течение 45 мин при комнатной температуре. Отменить жидкости и мыть каждой пластины 6 раз PBST (300 мкл / лунку). Подготовка субстрата решение следующей инструкции производителей (вектор синий А.П. субстрата III): Развести реагенты в 100 мМ Трис HCl рН 8,2 буфере. Пипетка 50 мкл / лунку раствора субстрата. Выдержите при комнатной температуре до тех пор, пока синий цвет начинает развиваться (примерно 30 мин). Откажитесь жидкости и мыть тарелки с большим количеством ЦТ 2 O. Снять нижнюю пластину, чтобы выставить мембрану, промойте назад скважин и позволяют пластины высохнуть на воздухе. Читайте пластины на immunospot анализатора изображений или ELISPOT читателя (таблица 1), или вручную, с помощью стереомикроскопа. Кроме того, держать тарелкив темноте при комнатной температуре до чтения. Из-за высокой устойчивости субстрата реакции, качество сохраняется в течение нескольких лет. ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки и концентрации антигена были оптимизированы, чтобы избежать скважин с бесчисленными пятнами 23,24,27,37. Вполне возможно, что формирование бесчисленные пятна возникают в различных условиях, или из-за биологических вариаций. Если это так, концентрация клеток должны быть оптимизированы таким образом получается читаемый ответ подсчета место. 7. Планшеты Чтение и анализ данных Выполнение анализа в соответствии с сотовой Technology Limited (CTL) ELISPOT ридере направляющей (Таблица 1). После того, как на счету пятна получаются для каждого из скважин, вычислить среднее между дубликатами. Специфический иммунный ответ к каждому антигенным стимулом рассчитывается путем вычитания среднего количества пятен в нестимулированных скважин с, что антиген-стимулированной скважин.

Representative Results

Примерно один месяц после аэрозольной инфекции M. Bovis (10 4 колониеобразующих единиц), от инфицированных РВМС (N = 8) и контрольные животные (N = 8) культивировали в присутствии антигенов и IL-2 в течение 13 дней. Развитие реакций TCM после заражения определяли с использованием IFN-γ ELISPOT анализа. Представитель Tcm (в присутствии или в отсутствии БТР) и экс естественных ИФН-γ ELISPOT ответы от инфицированных животных (трех животных) и неинфицированных животных (одно животное), показаны на рисунке 1. Успешного долгосрочного ИФН-γ ELISPOT результаты анализа в клетках, производящих IFN-γ (спот-клеток, образующих, SFC) при вынужденной условиях и почти полное отсутствие ответа от незараженных животных и под нестимулированных условиях. Кроме того, сильный Т-клеточный ответ должно происходить в ответ на PWM. Конкретные ответы на М. Bovis были оценены PPD-B или Решат-6: CFP10 антигенной стимуляции. Как показано на рисунке1, прочная КПП и экс VIVO ответы на PPD-B и Решат-6: CFP10 были обнаружены на всех трех М. Бови -infected животных. Минимальная чтобы не трлн.куб.м и бывших естественных условиях ответов были обнаружены с контрольным животным. Кроме того, присутствие АРС была необходима для оптимальных ответов TCM от инфицированных животных, как показали значительно сниженным ответов долгосрочными клеток, культивированных в отсутствие аутологичных АРС. Ответ ИФН-γ по МНПК от М. Бови инфицированных и неинфицированных животных представлены на рисунке 2. У каждого животного из ПФС номер рассчитывали как среднее число ПФС в одинаковых образцов в ответ на PPD-B минус соответствующего реагирования на одних СМИ. Ответы были оценены на 10 6 клеток. Ответы отличались (P <0,05) на основе ВИЧ-статуса, наличия или отсутствия БТР и продолжительности культивирования (т.е.., Долгосрочные культура против экс естественных условиях культуры). <table border="0" cellpaddinг = "0" = CELLSPACING "0"> Приобретение образ пластин 1. Включите машину 2. Открыть "Иммуно Захват" Версия программного обеспечения 6.3. 3. Шаг 1: Выберите тип плиты. 4. Шаг 2: нагрузка пластины. 5. Шаг 3: выбрать параметры сканирования. 6. Шаг 4: начать сканирование. 7. Получить общее изображение пластины. 8. Извлечь пластину. 9. Закройте программное обеспечение «Иммуно Capture". Подсчет пятна образующих единиц 1. Откройте "Иммуно пятна Capture" версии 5.0. 2. Выберите объективистские Тип T: нормально. 3. Выберите модуль подсчета: умный граф. 4. Шаг 1: нагрузка пластины. 5. Шаг 2: определить параметры подсчета: тест точность распознавания пятна на скважинах с различными пятнами. 6. Начните автоматический подсчет. Контроль качества 1. Открыть "Immunospot Захват" Версия программного обеспечения 5.0. 2. Выберите модуль подсчета: контроль качества. 3. Шаг 1: нагрузка пластины. 4. Шаг 2: Анализ Выделенные скважин индивидуально. 5. Завершите контроль качества. Таблица 1 – AutoImmun Диагностика ELISPOT приобретение читатель изображения и сотовый считая процедуру. ove_content "FO: Keep-together.within-странице =" всегда "> Рисунок 1. Изображение скважин с долгосрочной культурной ИФН γ ELISPOT анализа. Выращенный ИФН-γ ELISPOT анализ выполняли approximatelyone месяц после заражения вирулентным M. Бови (три животных). Незараженных животных были включены в качестве контрольных (одно животное) линии Долгосрочные клеток были получены путем стимулирования РВМС с коктейлем рекомбинантного Ag85A (1 мкг / мл), TB10.4 (1 мкг / мл), Решат-6.: CFP10 (1 мкг / мл) и PPD-B (5 мкг / мл) в течение 13 дней с последующим переходом на ELISPOT пластины в присутствии или в отсутствие аутологичной APC. Краткосрочные клетки состоял из РВМС, изолированных на 13 день и высевали непосредственно в ELISPOT пластины. Долгосрочные и краткосрочные клетки стимулировали PPD-B (10 мкг / мл), Решат-6: CFP10 (1 мкг / мл), одна средняя или лаконоса митоген (5 &# 956; г / мл) в течение 24 ч. Рисунок 2. Типичные результаты долгосрочного культурного ИФН γ ELISPOT ответ на М. Бови очищенный белковый дериват (PPD-B). Искусственный ИФН-γELISPOT анализ проводили approximatelyone месяц после заражения вирулентным M. Бови (восемь животных). Незараженных животных были включены в качестве контрольных (восемь животных Долгосрочные клетки были получены путем стимулирования РВМС с коктейлем рекомбинантного Ag85A (1 мкг / мл), TB10.4 (1 мкг / мл), Решат-6: CFP10 (1 мкг / мл) и PPD-B (5 мкг / мл) в течение 13 дней с последующим переходом на ELISPOT планшеты в присутствии или в отсутствие аутологичных АРС. Краткосрочные клетки состоит из РВМС выделяли на 13-й день и высевали непосредственно в ELISPOT пластины . Долгосрочные и шоRT-термин клетки стимулировали PPD-B (10 мкг / мл) или только среды в течение 24 ч. Конкретные ответы от каждого животного (SFC / 10 6 клеток) представлены как ответ на PPD-B (в среднем дубликатов проб) минус ответ на только СМИ.

Discussion

Производство IFN-γ в долгосрочных культурных ELISPOT анализов, как правило, из-за трлн.куб.м в людях, но, как эта реакция развивается в культуре плохо изучены. Будь Tcm присутствуют в обращении и расширяться в пробирке, или ответы Tcm результате дифференциации эффектора и ТЕА клеток в течение трлн.куб.м культуры не известно. Тем не менее, исследования с образцами из людей обнаружили, что CD4 + T-клетки из экс естественных условиях и долгосрочных культивируют ИФН-γ ELISPOT анализы, не связанных эпитопные особенности, подразумевая, что ответы Tcm не развиваются из клеток-эффекторов 28. Очевидно, что продолжительность реакции может изменяться, но если патоген зазора достигается, в конечном итоге, как экс виво и ответы Tcm снижаться. Кроме того, реакции длительных культур измеряется рано и долго после антигенной грунтовки (когда ответ эффектор ниже) показано, коррелируют, указывая, что циркулирующий популяции TCM рано и долго после антигенная грунтовки, остается связанным в естественных условиях. С другой стороны, величина экс естественных ответ, кажется, не быть связана с величиной отклика памяти 29. Эти результаты показывают, что долгосрочные культивированный IFN-γ ELISPOT ответы в результате расширения в пробирке Tcm и ассоциированного ослаблением реакций эффекторных в образце, а не дифференциации клеток-эффекторов в фенотипе TCM.

С крупного рогатого скота, относительный вклад эффекторов и памяти подмножеств в ответах обнаруживается долгосрочных ИФН-γ ELISPOT анализов не известны. Последние исследования показывают, корреляция между вакциной вызвало долгосрочные культурные IFN-γ ELISPOT ответы и защиту от последующей экспериментальной инфекции M. Бови 23-24. Было сообщено, что слабые долгосрочные IFN-γ ELISPOT ответы на вакцинации связаны с отсутствием защиты 30. Оба живут и убиваютред вакцины индуцируют аналогичные бывших естественных ИФН-γ ELISPOT ответы, но вакцинация БЦЖ с живой вызывает сильные долгосрочные культурные IFN-γ ELISPOT ответы, чем сделать убитых вакцинные препараты. Интересно, что живые вакцины защищают, а убитые препараты не обеспечивают защиту против заражения вирулентным туберкулезной микобактерии 31-32, 33.

Оценка ответов TCM также возможно путем сортировки эти клетки из РВМС. Прямая обогащение Tcm из РВМС, однако, требует дорогих устройств, высококвалифицированных личной и трудно, поскольку эти клетки не многочисленны в кровотоке. Долгосрочный культура РВМС обеспечивает обогащение трлн.куб.м над ТЕА и эффекторных клеток без дорогостоящих приборов; Однако, поскольку эти Т-клеточные популяции расширены в пробирке они могут быть менее представитель в естественных условиях ответов памяти. Можно получить доступ к ответов ИФН-γ памяти (с помощью долгосрочного культуру или TCM-тоING стратегии) ​​от других, чем ELISPOT анализов, таких как: ИФА цитокинов 34, массивов цитокинов борта (СВА), внутриклеточного окрашивания (ICS), или цитокинов белковыми массивов (CPA). Эти методы; Однако, как правило, менее чувствительны, чем ELISPOT анализах 35.

Преимущество ELISPOT является его способность обнаруживать немедленного захвата цитокина вскоре после его выхода предотвращения разбавления в надосадочной жидкости и деградации ферментативным расщеплением или поглощения цитокинов другими клетками. ELISPOT анализы обнаружить отдельные клетки, продуцирующие цитокины, обеспечивающие точные результаты даже в условиях низкой сигнала сценариев шума (т.е., низкие удельные ответов) 35. Кроме того, с ICS, обнаружение цитокинов до выпуска может привести к ложной идентификации клеток, продуцирующих цитокины (например., В связи с пост-трансляционной модуляции до или во время процесса секреторной) 34. Ингибиторы транспорта, используемые с ICS анализов, чтобы минимизировать секрецию цитокиновво антигенной стимуляции (известный как Гольджи стоп белков) ограничить продолжительность стимуляции клеток из-за токсичности клеток этих белков, в конечном счете, влияющих на продукцию цитокинов 35.

С учетом сказанного – CBA, ВМС и МПС полезные методы измерения нескольких цитокинов одновременно и / или для определения экспрессии маркера клеточной поверхности (т.е. с ICS.). Таким образом, эти методы могут быть использованы в сочетании с IFN-γ ELISPOT анализа 36. В то время как предыдущие бычьего туберкулеза исследования эффективности вакцины измеряли ответов TCM с помощью ELISPOT анализа, обнаружение ответов TCM другими методами, скорее всего, дают сопоставимые результаты. Важно отметить, что ELISPOT анализ является менее дорогостоящим и более простым для выполнения, чем СВА, CPA и анализа ИКС методов 34. Руководство подсчет SFC является альтернативой автоматизированной подсчета и ELISPOT пластины можно хранить при комнатной температуре в течение длительного периода времени с минимальной потерей качества, до или после точечной Counting 37.

Долгосрочная культивируют ИФН-γ ELISPOT ответ был применен для оценки ответов памяти от человека и крупного рогатого скота, при оценке ответов вакцины туберкулеза 14-16,31-32,33. Ответы Tcm также предполагается играть значительную роль в ответах принимающих несколько других инфекционных агентов крупного рогатого скота, таких как:. Микоплазмы тусоШез подвид тусоШез 42, Anaplasma marginale 38 и бычьего респираторно-синцитиальный вирус 39. Потенциально, долгосрочный анализ ELISPOT может быть адаптирована для других животных видов, цитокинов и инфекций. Эти более широкие приложения будут особенно полезны для ветеринарного применения иммунологии в связи с текущей ограниченной доступности специфических реагентов.

Ответы Tcm имеют решающее значение для защиты от нескольких инфекций, но их измерения в ранние сроки после инфекции / иммунизации (для предсказания исхода болезни или эффективности вакцины) MAу громоздким. Анализ иммунного ответа при экс естественных условиях и коротких антигенных условиях стимуляция чаще представляют ответов эффекторных, в связи с перекрытием памяти и эффекторных реакций, особенно в начале становления иммунологической памяти. В контексте хронических заболеваний, при которых нагрузка антиген постоянное, Экс Vivo ответы будут оценивать клеточные ответы эффекторные или сочетание памяти и эффекторных клеток ответов. Долгосрочная культивируют IFN-γ ELISPOT анализа, описанные здесь, скорее всего, позволяет измерять ответов TCM, а не эффекторной Т-клетки или в сочетании CD4 + Т-клеточных ответов. Таким образом, долгосрочные культивируют IFN-γ ELISPOT анализ обеспечивает ценный подход для оценки Т-клеток памяти ответов и была с успехом использована для оценки реакции памяти нескольких видов на различных инфекций агентов 12-16, 20-25,29 , 31,33,34,38,39.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Исследования выполнены при поддержке Министерства сельского хозяйства США, ARS Cris: 3625-32000-104 и сельского хозяйства и продовольственной инициативы исследований Конкурсная Грант нет. 2011-67015-30736 от USDA Национальный институт продовольствия и сельского хозяйства. Мы благодарим Джессика Поллок, Эмма Frimml-Морган, Шелли Циммерман, Кристин Басс, Брюс Пеш, Молли Stafne, Аллен Дженсена, и Трейси Портер за отличную техническую помощь, а также Ребекка Мэдисон, Дуг Юинг, Кэти PILLE, Джей Штеффен, Дэвид Любберса Робин Zeisness, и Дэвид Panthen за отличную уходу и обращению с животными.

Materials

Sodium citrate (dihydrate) Various
Citric acid (monohydrate) Various
Dextrose Various
ELISPOT PVDF plate Various
Vectastain ABC – AP KIT Standard Vector Laboratories AK-5000
Vector Blue Alkaline Phosphatase Substrate Kit Vector Laboratories SK-5300
Ag85A Lionex LRP-0004.3 23, 24, 25, 37
TB 10.4 Lionex LRP-0061.6 23, 24, 25, 37
PPDb Prionics AG 7600055
rESAT-6:CFP10 Kind gift Dr. Minion, Iastate 23, 24, 25, 27,  37
Mouse anti-bovine IFN-γ Clone CC302 Serotec MCA1783B 23, 24, 25, 27,  37
Mouse anti-bovine IFN-γ Biotinylated Clone CC330 Serotec MCA2112 23, 24, 25, 27,  37
Mouse anti-bovine CD4 Clone CC8 Serotec MCA1653GA
Mouse anti-bovine CD45RO Clone IL116A Serotec MCA2434GA
Rat anti-human CCR7 Clone 3D12 Abcam ab95665
Mouse anti-bovine IFN-γ-Pe Clone CC302 Serotec MCA1783PE
Goat anti- mouse IgG2a- Alexa Fluor 350 Invitrogen A-21130
Goat anti-mouse IgG3 APC-CY7 SouthernBiotechnology 1080-193
Goat anti-rat IgG-APC Invitrogen A10540
BD Cytofix/Cytoperm™ BD Biosciences 554714
BrefeldinA Sigma-Aldrich B7651
Pokeweed Mitogen Sigma-Aldrich L8777
Recombinat human Interleukin 2 Sigma-Aldrich I7908
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Szabo, S. J., Kim, S. T., Costa, G. L., Zhang, X., Fathman, C. G., et al. Novel transcription factor, T-bet, directs Th1 lineage commitment. Cell. 100 (6), 655-669 (2000).
  2. Mullen, A. C., High, F. A., Hutchins, A. S., Lee, H. W., Villarino, A. V., et al. Role of T-bet in commitment of Th1 cells before IL-12-dependent selection. Science Signaling. 292 (5523), 1907 (2001).
  3. Mosmann, T. R., Cherwinski, H., Bond, M. W., Giedlin, M. A., Coffman, R. L. Two types of murine helper T cell clone. I. Definition according to profiles of lymphokine activities and secreted proteins. Journal of immunology. 136 (7), 2348-2357 (1986).
  4. Lighvani, A. A., Frucht, D. M., Jankovic, D., Yamane, H., Aliberti, J., et al. T-bet is rapidly induced by interferon-gamma in lymphoid and myeloid cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (26), 15137-15142 (2001).
  5. Masopust, D., Picker, L. J. Hidden memories: frontline memory T cells and early pathogen interception. Journal of immunology. 188 (12), 5811-5817 (2012).
  6. Sallusto, F., Lenig, D., Förster, R., Lipp, M., Lanzavecchia, A. Two subsets of memory T lymphocytes with distinct homing potentials and effector functions. Nature. 401 (6754), 708-712 (1999).
  7. Waters, W. R., Palmer, M. V., Thacker, T. C., Davis, W. C., Sreevatsan, S., et al. Tuberculosis immunity: Opportunities from studies with Cattle. Clinical and Developmental Immunology. 2011 (1), 1-11 (2011).
  8. Whelan, A. O., Villarreal-Ramos, B., Vordermeier, H. M., Hogarth, P. J. Development of an antibody to bovine IL-2 reveals multifunctional CD4 T(EM) cells in cattle naturally infected with bovine tuberculosis. PLoS ONE. 6 (12), e29194 (2011).
  9. Streitz, M., Tesfa, L., Yildirim, V., Yahyazadeh, A., Ulrichs, T., et al. Loss of receptor on tuberculin-reactive T-cells marks active pulmonary tuberculosis. PLoS ONE. 2 (8), e735 (2007).
  10. Soares, A. P., Scriba, T. J., Joseph, S., Harbacheuski, R., Murray, R. A., et al. Bacillus Calmette-Guérin vaccination of human newborns induces T cells with complex cytokine and phenotypic profiles. Journal of immunology. 180, 3569-3577 (2008).
  11. Waters, W. R., Palmer, M. V., Buddle, B. M., Vordermeier, H. M. Bovine tuberculosis vaccine research: historical perspectives and recent advances. Vaccine. 30 (16), 2611-2622 (2012).
  12. Letvin, N. L., Mascola, J. R., Sun, Y., Gorgone, D. A., Buzby, A. P., et al. Preserved CD4+ central memory T cells and survival in vaccinated SIV-challenged monkeys. Science. 312 (5779), 1530-1533 (2006).
  13. Mattapallil, J. J., Douek, D. C., Buckler-White, A., Montefiori, D., Letvin, N. L., et al. Vaccination preserves CD4 memory T cells during acute simian immunodeficiency virus challenge. The Journal of experimental medicine. 203 (6), 1533-1541 (2006).
  14. Lindenstrom, T., Knudsen, N. P. H., Agger, E. M., Andersen, P. Control of Chronic Mycobacterium tuberculosis .infection by CD4 KLRG1- IL-2-secreting central memory cells. The Journal of Immunology. 190 (12), 6311-6319 (2013).
  15. Todryk, S. M., Bejon, P., Mwangi, T., Plebanski, M., Urban, B., et al. Correlation of memory T cell responses against TRAP with protection from clinical malaria, and CD4 CD25 high T cells with susceptibility in Kenyans. PLoS ONE. 3 (4), e2027 (2008).
  16. Webster, D. P., Dunachie, S., Vuola, J. M., Berthoud, T., Keating, S., et al. Enhanced T cell-mediated protection against malaria in human challenges by using the recombinant poxviruses FP9 and modified vaccinia virus Ankara. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (13), 4836-4841 (2005).
  17. Rie, A., Warren, R., Richardson, M., Victor, T. C., Gie, R. P., et al. Exogenous reinfection as a cause of recurrent tuberculosis after curative treatment. New England Journal of Medicine. 341 (16), 1174-1179 (1999).
  18. Caminero, J. A., Pena, M. J., Campos-Herrero, M. I., Rodríguez, J. C., Afonso, O., et al. Exogenous reinfection with tuberculosis on a European Island with a moderate incidence of disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 163 (3), 717-720 (2001).
  19. Sallusto, F., Lanzavecchia, A., Araki, K., Ahmed, R. From vaccines to memory and back. Immunity. 33 (4), 451-463 (2010).
  20. Millington, K. A., Gooding, S., Hinks, T. S. C., Reynolds, D. J. M., Lalvani, A. Mycobacterium tuberculosis.-specific cellular immune profiles suggest bacillary persistence decades after spontaneous cure in untreated tuberculosis. The Journal of infectious diseases. 202 (11), 1685-1689 (2010).
  21. Su, L. F., Kidd, B. A., Han, A., Kotzin, J. J., Davis, M. M. Virus-specific CD4(+) memory-phenotype T cells are abundant in unexposed adults. Immunity. 38 (2), 373-383 (2013).
  22. Goletti, D., Butera, O., Bizzoni, F., Casetti, R., Girardi, E., Poccia, F. Region of difference 1 antigen-specific CD4+ memory T cells correlate with a favorable outcome of tuberculosis. The Journal of infectious diseases. 194 (7), 984-992 (2006).
  23. Waters, W. R., et al. Efficacy and immunogenicity of Mycobacterium bovis. DeltaRD1 against aerosol M. bovis. infection in neonatal calves. Vaccine. 27 (8), 1201-1209 (2009).
  24. Hope, J. C., et al. Identification of surrogates and correlates of protection in protective immunity against Mycobacterium bovis. infection induced in neonatal calves by vaccination with M. bovis. BCG Pasteur and M. bovis. BCG Danish. Clinical and Vaccine Immunology. 18 (3), 373-379 (2011).
  25. Thom, M. L., et al. Duration of immunity against Mycobacterium bovis. following neonatal vaccination with bacillus Calmette-Guérin Danish: significant protection against infection at 12, but not 24, months. Clinical and Vaccine Immunology. 19 (8), 1254-1260 (2012).
  26. Aabye, M. G., Ravn, P., Johansen, I. S., Eugen-Olsen, J., Ruhwald, M. Incubation of whole blood at 39°C augments gamma interferon (IFN-γ)-induced protein 10 and IFN-γ responses to Mycobacterium tuberculosis .antigens. Clinical and vaccine immunology : CVI. 18 (7), 1150-1156 (2011).
  27. Maue, A. C., Waters, W. R., Davis, W. C., Palmer, M. V., Minion, F. C., Estes, D. M. Analysis of immune responses directed toward a recombinant early secretory antigenic target six-kilodalton protein-culture filtrate protein 10 fusion protein in Mycobacterium bovis.-infected cattle. Infection and Immunity. 73 (10), 6659-6667 (2005).
  28. Godkin, A. J., Thomas, H. C., Openshaw, P. J. Evolution of epitope-specific memory CD4(+) T cells after clearance of hepatitis C virus. Journal of immunology. 169 (4), 2210-2214 (2002).
  29. Todryk, S. M., et al. The relationship between human effector and memory T cells measured by ex vivo and cultured ELISPOT following recent and distal priming. Immunology. 128 (1), 83-91 (2009).
  30. Vordermeier, H. M., et al. Viral booster vaccines improve Mycobacterium bovis. BCG-induced protection against bovine tuberculosis. Infection and Immunity. 77 (8), 3364-3373 (2009).
  31. Orme, I. M. Induction of nonspecific acquired resistance and delayed-type hypersensitivity, but not specific acquired resistance in mice inoculated with killed mycobacterial vaccines. Infect. Immun. 56 (12), 3310-3312 (1988).
  32. Griffin, J. F., Mackintosh, C. G., Slobbe, L., Thomson, A. J., Buchan, G. S. Vaccine protocols to optimise the protective efficacy of BCG. Tubercle and lung disease : the official journal of the International Union against Tuberculosis and Lung Disease. 79 (3), 135-143 (1999).
  33. Buddle, B. M., et al. Protection of cattle from bovine tuberculosis by vaccination with BCG by the respiratory or subcutaneous route, but not by vaccination with killed Mycobacterium vaccae.. Research in veterinary science. 59 (1), 10-16 (1995).
  34. Lehmann, P. V., Zhang, W. Unique strengths of ELISPOT for T cell diagnostics. Methods in Molecular Biology. 792 (Chapter 1), 3-23 (2011).
  35. Tincati, C., Iii, A. J. C., Snyder-Cappione, J. E. Distinguishing latent from active Mycobacterium tuberculosis. infection using Elispot assays: looking beyond interferon-gamma). Cells. 1 (2), 99-99 (2012).
  36. Lash, G. E., Pinto, L. A. Multiplex cytokine analysis technologies. Expert review of vaccines. 9 (10), 1231-1237 (2010).
  37. Vordermeier, M., Whelan, A. O. ELISPOT assays to enumerate bovine IFN-γ-secreting cells for the development of novel vaccines against bovine tuberculosis. Methods in molecular biology. 792, 219-227 (2012).
  38. Han, S., Norimine, J., Palmer, G. H., Mwangi, W., Lahmers, K. K., Brown, W. C. Rapid deletion of antigen-specific CD4+ T cells following infection represents a strategy of immune evasion and persistence for Anaplasma marginale. Journal of immunology. 181 (11), 7759a-7769a (2008).
  39. Helden, M. J. G., et al. Pre-existing virus-specific CD8(+) T-cells provide protection against pneumovirus-induced disease in mice. Vaccine. 30 (45), 6382-6388 (2012).

Tags

Interferon-γELISPOT AssayEffector T CellsMemory T CellsCentral Memory T CellsEffector Memory T CellsCattleTuberculosisVaccinationAntigen StimulationLong-term Culture

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Maggioli, M. F., Palmer, M. V., Vordermeier, H. M., Whelan, A. O., Fosse, J. M., Nonnecke, B. J., Waters, W. R. Application of Long-term cultured Interferon-γ Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle. J. Vis. Exp. (101), e52833, doi:10.3791/52833 (2015).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image