JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Sığırlarda Efektör ve hafıza T Hücre Yanıtları değerlendirilmesi için uzun vadeli kültürlü İnterferon-γ Enzim-linked immünospot Testi Uygulaması

Published: July 11, 2015
doi:
10.3791/52833
, , , , , ,
1Infectious Bacterial Diseases Research Unit, National Animal Disease Center, Agricultural Research Service,United States Department of Agriculture, 2Department of Veterinary Pathology, College of Veterinary Medicine,Iowa State University, 3UK Veterinary Laboratories Agency, 4Visual Services, National Centers for Animal Health, Animal and Plant Health Inspection Service,United States Department of Agriculture

Summary

Uzun süreli kültürlenmiş interferon-γ enzime bağlı immünospot deneyi merkezi bellek tepkilerinin bir ölçüsü olarak kullanılır ve koruyucu, anti-mikobakteriyel aşı cevabı ile bağıntılı olduğu ortaya konmaktadır. Bu testte, periferal kan tek-çekirdekli hücreleri, mikobakteriyel antijenlerin ve interlökin-2, 14 gün için, etkinleştirme farklılaşma ve merkezi bellek T hücrelerinin genişlemesi ile stimüle edilir.

Abstract

Efektör ve hafıza T hücreleri antijen tanıma aşağıdaki naif hücrelerin gelişim programlama yoluyla oluşturulur. Enfeksiyon genişletme aşamasında üretilen T hücrelerinin% 95'e kadar kontrol edilirse elimine edilir (örneğin., Kasılma fazı) ve hafıza T hücreleri, bazen ömür boyu devam etmektedir. İnsanlarda, bellek T hücrelerinin iki fonksiyonel olarak farklı alt-gruplar lenf nodu homing reseptörler sentezlenmesi göre tarif edilmiştir. Merkezi bellek T hücreleri CC kemokin reseptörü 7 ve CD45RO ifade esas olarak, ikincil lenfoid organların T-hücresi alanlarda yer almaktadır. Efektör hafıza T hücreleri, CD45RO ifade eden periferik veya iltihaplı dokulara lenfosit ile ilişkili CCR7 ve ekran reseptörlerini yoksundur. Efektör T hücreleri CCR7 veya CD45RO ancak bu tür interferon-γ gibi antijen üretmek efektör sitokinler ile karşılaşma sırasında ya ifade yoktur. İnterferon-γ salınım deneyleri sığır ve insan tüberküloz tanısı için kullanılır vetemel olarak efektör ve efektör bellek T hücre yanıtları algılamak. İnsanlarda simian bağışıklık sistemi bozucu virüs, insan olmayan primatların enfeksiyon, tüberküloz, farelerde ve sıtma gösterildiği gibi aşılama CD4 + T hücreleri tarafından merkezi bellek T hücresi tepkileri, diğer taraftan, aşı etkinliğini öngörmek için kullanılabilmektedir. Fareler ve insanlar dahil olmak üzere sığır yayınlanmamış veriler çeşitli çalışmalar, interferon-γ ELISPOT deneyleri merkezi bellek T hücresi tepkilerini ölçmek olduğunu göstermiştir. Bu testte, periferal kan mononükleer hücreleri, 10-14 gün (uzun dönemli kültür) için antijen konsantrasyonunun azaltılması efektör yanıtları tepe ve azalmaya izin kültürlenmiştir; merkezi bellek T hücreleri ayırt kolaylaştırılması ve kültür içinde genişletmek.

Introduction

Efektör ve hafıza T hücreleri, antijen tanıma sonra naif CD4 + T hücrelerinin gelişim programlama yoluyla oluşturulur. Sitokin üreten hücrelere naif CD4 + T hücrelerinin farklılaşması doğuştan gelen bağışıklık hücreleri, antijen T hücrelerine sunum, ko-stimülasyon ve polarize sitokin üretiminde elde edilen transkripsiyon değişiklikler ile patojen kabul edilmesini gerektirmektedir. Örneğin antijen sunan hücreler, bir araya antijen tanıma, sinyal ileticisi ve bir aktivatör ile sinyal ile T yardımcı içine 1 (Th1) hücreler 1,2 T hücrelerinin farklılaşmasını teşvik, hücre içi patojenler, tepki olarak interlökin (IL) -12 üretmek Transkripsiyon 4 (STAT 4) ve T-hücresi aktivasyonu kutusu, IL-2 üretimi, klonal genişleme ve interferon (IFN) -γ üretimi 3,4 giden, T hücreleri (T-bahis) olarak ifade edilmiştir. Enfeksiyon kontrol edilirse, genleşme fazı esnasında üretilen T hücrelerinin% 95'e kadar (yani, daralma ortadan kalkarfazı) ve hafıza T hücreleri bir ömür boyu 5, bazen kalır. Sallusto ve ark., 6, lenf düğümü homing reseptörler sentezlenmesi dayalı olarak insanlarda hafıza T hücreleri, iki işlevsel ayrı alt saptandı. Merkezi bellek T-hücreleri (TCM) CC kemokin reseptörü (CCR) -7 ve CD45RO ifade esas olarak, ikincil lenfoid organların T-hücresi alanlarda yer almaktadır. TCM efektör fonksiyonu, düşük aktivasyon eşiği ve yüksek IL-2 üretimi ve çoğalma kapasitesini korumak sınırlıdır. Efektör hafıza T hücreleri (Tem), CD45RO ifade eden periferik veya iltihaplı dokulara güdümlü için CCR7 ve ekran reseptörlerini yoksundur. Efektör hücreler CCR7 veya CD45RO ya ekspres ama derhal antijen tanıma üzerine, bu tür IFN-γ gibi efektör sitokinler, üretemezler.

IFN-γ salınım analizleri (IGRA) sığır ve insan tüberküloz 7 tanısında kullanılır. Mycobacterium bovis insan ca ise sığır tüberkülozu (BTB) temel maddedirTüberküloz ses Mycobacterium tuberculosis başta kaynaklanır. Bu testler, tam kan ya da periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMC) ile ELISA ile ya da ELISPOT teknikleri kullanılarak IFN-γ üreten hücrelerin saptanması yoluyla ölçülür 16 saat ve süpernatan içinde IFN-γ üretimi 24 için mikobakteriyel antijenlerin çoğu ile uyarılmaktadır. Kısaca, uyarım periyodu bir sonucu olarak (örneğin., 16-24 saat) ve hızlı bir sitokin üretimi, ex vivo deneyler, esas olarak, efektör ve TEM yanıtları algılamak. Bu durum, bu kültürler 8-10 hücre popülasyonlarının akış sitometrik analizi ile teyit edilmiştir.

Ex vivo IFN-γ yanıtları rutin sığır tarafından tepkilerini ölçmek için kullanılanlar da dahil olmak üzere tüberküloz aşıları, bir bağışıklık tepkisi paneli değerlendirmeye dahil edilmiştir. En etkili sığır tüberkülozu aşıları belirli IFN-γ tepkiler değil, IFN-γ yanıtları teşvik tüm aşılar protectiv vardıre. Ayrıca, enfeksiyon öncesi ölçülen, aşılama ile ortaya çıkarılan, IFN-γ seviyeleri, gerekli koruma ile ilişkili değildir. Örneğin, farklı bir BCG suşları içindeki koruma seviyesi 11 rağmen, ex vivo IFN-γ karşılığının uyarılması için farklı kapasitelere sahiptir. Böylece, ex vivo IGRA tüberküloz tanısı için ve aşı immünojenikliğini erişmek için değerlidir; Ancak, aşı etkinliğinin belirleyicileri olarak kullanımı sınırlıdır. İnsanlarda 15,16 fareler 14 ve sıtma insan olmayan primatlarda 12,13 tüberküloz, simian bağışıklık sistemi bozucu virüs (SIV) enfeksiyonu ile gösterildiği gibi, aşılamaya TCM tepkiler, diğer taraftan, aşı etkinliğini öngörmek için kullanılabilmektedir.

Patojen boşlukla sonuçlanan etkili bir bağışıklık tepkisi sonra TCM korunur ve, aynı madde ile nihai bir ikinci enfeksiyon ile koruma sağlar. Bu senaryoya bir istisna M. ise Tüberküloz INFEinsanların ction olan iyileştirici anti-mikobakteriyel tedavisi alan hastalar yeniden enfeksiyon için 17,18 duyarlıdır. Ayrıca, kronik enfeksiyonlar sırasında immünolojik bellek yöneten olaylar, antijenik stimülasyon devam buradaki iyi 19 anlaşılmamıştır. Böyle insan immün yetmezlik virüsü (HIV) ve tüberküloz gibi kronik enfeksiyonlarda sırasında önemli bir TCM tepkisi olumlu sonuç 20,21 (HIV, tüberküloz ve subklinik hastalığı olan, örneğin, gecikme) ile ilişkilidir. Farelerde ve insanlarda yapılan çeşitli çalışmalarda, uzun vadeli kültürlenmiş, IFN-γ ELISPOT deneyleri TCM yanıtlar 16,20-22 ölçmek olduğunu göstermiştir. Bu testte, PBMC, 10-14 gün için antijen konsantrasyonunun azaltılması efektör yanıtları tepe ve azalmaya izin kültürlenmiştir; TCM kolaylaştırılması ayırt etmek ve kültür içinde genişletmek.

Uzun süreli kültürlenmiş, IFN-γ ELISPOT deneyleri, aynı zamanda veterinerlikte kullanılmıştırAraştırma, ancak, hücrelerin fenotipi nedeniyle önemli reaktifler eksikliği, CCR7, özellikle bir antikora değerlendirmek zor olmuştur. Etkili sığır tüberkülozu aşılar [örneğin. M. tek bir doz kullanılarak bovis Bacille Calmette Guerin (BCG), BCG bovis ΔRD1] korunması ile ilişkili aşılama sonrası uzun süreli kültürlenmiş IFN-γ ELISPOT yanıtları (yani, daha düşük mikobakteriyel yükü ortaya çıkarmak. Viral vektörlü Antijen 85A alt birim aşı veya zayıflatılmış M ardından ve azalmış TB-ilişkili patoloji) öldürücü M. ile sonraki tehdide karşı bovis 23,24. Ayrıca, uzun süreli PBMC kültürleri içinde antijene spesifik IFN-γ salgılayan hücrelerin sayısı 12 ayda yüksek ama koruma saptanabilir sonrası M. derecesi ile ilişkilendirerek, yenidoğan buzağıların BCG aşısından sonra 24 ayda azalma bovis meydan 25. Bu senaryoda, kültürlenmiş IFN-γ ELISPOT a,, aşı etkinliğini tahmin yüksek maliyet etkinlik denemeleri için aşı adayları öncelik için bir araç sağlamak için n önemli bir araçtır. Buna ek olarak, kültür ELISPOT teknikleri farklı araştırma alanında, çeşitli amaçlar için antijenler veya antikorlar değiştirerek, çeşitli ana, patojenler ve sitokinler için adapte edilebilir.

Protocol

1. Aşağıdaki Çözümler hazırlayın Tam RPMI (cRMPI), 10% (hacim / hacim) konsantrasyonunda, glutamin (2 mM), sodyum piruvat (1 mM), temel olmayan amino asitler (0.1 uM), penisilin fetal sığır serumu (FBS) ilave edilerek Hazırlama -streptomycin (100 birim / ml penisilin ve 0.1 mg / ml streptomisin) ile RPMI 1640 içinde 2-merkaptoetanol (50 mM). Damıtılmış su içinde bir sodyum sitrat (77 mM), sitrik asit (38 uM) ve dekstroz (122 uM), karıştırma ile, 2 x asit sitrat dekstroz hazırlayın. Hazırlama Ca + 2, Mg + 2 serbest fosfat tamponlu salin (PBS) pH 7.2: NaCI (137 mM), KCI (2.7 mM), Na 2 HPO 4 (dibazik, 10 mM), KH 2 PO 4 (monobazik, 2 mM) damıtılmış su içinde; pH'ı 7.2'ye ayarlayın. PBS (hacim / ağırlık, PBS içinde 1 g / 100 mi), sığır serum albümini ilave edilerek PBS,% 1 (PBS,% 1 BSA) hazırlayın. PBS +% 0.05 tween 20 hazırlayınPBS (hacim / hacim, aranın 500 ul PBS 20/1 L) içine,% 0.05 Tween 20 ilave etmek suretiyle (PBST). Damıtılmış su içinde Tris (100 mM), HCI (0.50 mM), karıştırarak, 100 mM Tris HCI pH 8.2 tampon hazırlayın. (35 etil alkol / ml damıtılmış su içinde 100 mi, hacim / hacim) damıtılmış su içinde bir etil alkol (saflık ≥99.5%) seyrelterek% 35 etanol çözeltisi hazırlayın. Filtre cRPMI, 2 x asit sitrat dekstroz, PBS, PBS 0.22 mikron filtreleri kullanarak% 1 BSA sterilize edin. 2. Uzun vadeli Kültür Hücreler (14 Gün Protokolü) (Birinci gün) CRPMI iki kez son konsantrasyonda antijen çözümler hazırlayın. Antijen seçimi önemlidir ve çalışmanın amacına uygun olmalıdır. Rekombinant M. seyreltin (her bir antijenin, nihai konsantrasyon 1 ug / ml), tüberküloz, 2 ug / ml TB10.4 ve antijen Ag85A antijenleri. Seyreltik M. bovis saflaştırılmış protein türevi10 ug / ml (PPD-B PRIONICS Ag) (nihai konsantrasyon 5 ug / ml). 2 ug / ml (1 ug / ml nihai konsantrasyon): yeniden birleştirici erken salgılama antijenik hedef 6 (ESAT-6) ve kültür filtre ürünü proteini 10 (CFP-10) füzyon proteini (CFP10 RESAT-6) seyreltin. NOT: Bu antijenler, tüberküloz mikobakterilerin antijenleri indükleyici immünodominant IFN-γ ve M. gelen PBMC uyarmak için dahil edilebilir bovis hayvanları enfekte. BCG veya M. bu suşların silinir (yani, RD1) bu antijenleri kodlayan bölge, CFP10: bovis ΔRD1 hayvanlar RESAT-6 yanıt yok aşı. reşat-6: Bu çalışmada kullanılan CFP10 Dr. C. Minion, Iowa State Üniversitesi bir tür hediye edildi. TB10.4 ve antijen Ag85A virülan ve aşı M. mevcut imüno antijenleri bovis 37 suşları. PPDB bir saflaştırılmış protein türevi gibi, tüberküloz olmayan mikobakteriler ile ortak antijenler de dahil olmak üzere pek çok antijenlerin bir komplekstir. InfecCFP10 11: aşılanan hayvanlar Reşat-6 yanıt gerekirken, (CFP10 ve PPDb: TB10.4, Ag 85A, reşat-6 olmak üzere) ted hayvanların potansiyel tüm antijenlere yanıt verecektir. Levha 500 ul / 24 oyuklu bir plaka içerisinde her bir hayvan için dörtlü antijen çözeltisi de. Bu protokol, bir havuz olarak antijenleri kullanmak; böylece tüm kuyular tüm antijenleri ve bu adımı (örneğin, null veya mitojen olarak) hiçbir denetimleri içeren kullanın. 39 ° C /% 5 CO2 ile plaka inkübe edin. sığır normal sıcaklığı C 39 °; Bu şekilde, bazı araştırmacılar, sığır hücre kültürü için 39 ° C kullanmaktadır. Ayrıca, insan hücreleri ile bazı durumlarda, 39 ° C'de hücre kültürü yarar 26,30 eklendi sağlar. 2 x asit sitrat dekstroz için 6 ml, 16 veya 18 G hipodermik iğne ile birlikte Ön yük şırıngalar; ve boyun damarından sığır kan 60 ml toplamak. Periferik kan ince beyaz tabaka fraksiyonların standart yoğunluk gradyanlı santrifugasyon sureti ile PBMC izoleMaue ve arkadaşları tarafından tarif edildiği gibi 4 x 10 6 hücre / ml hücre konsantrasyonu ayarlanarak değiştirilebilir. 27 Antijen içine hücreleri (500 ul / oyuk) ilave edin, her hayvan için (adım 2.5) için dört kez, 24 yuvalı plaka önceden yüklenmiş. 39 ° C /% 5 CO2 ile plaka inkübe edin. (Gün üç ve yedi) Steril teknik kullanılarak, dikkatli bir şekilde, hücre katmanı bozmadan her gözden üst fazın 500 ul çıkarın. IL-2 içeren 500 ul / kuyu ilave cRPMI ile iyice hacmini artırmak (de, yani 30 U / ul, 15 U / rekombinant insan IL-2 Sigma I7908). 39 ° C /% 5 CO2 ile plaka inkübe edin. (Gün 10 ve 12) Steril teknik kullanılarak, her bir oyuktan süpernatan 750 ul çıkarın. (IL-2) olmadan 750 ul / cRPMI kuyusuna ile hacmini doldurun. 39 ° C /% 5 CO2 ile plaka inkübe edin. <pclass = "jove_title"> 3. ELİSPOT Deneyi (Üç Gün Protokolü) (Birinci gün (Uzun süreli kültür protokolünün 12. gün)) Kaplama hücreleri ne hatalardan kaçınmak için, numunelerin her biri için uygun ELISPOT plaka etiketleyin: Uzun vadeli hücreler ve APC 've ex vivo / kısa dönemli hücreleri olmadan antijen sunan hücreler (APCler), uzun süreli hücreleri (Şekil 1). Iki kopya halinde, en azından yapılmalıdır her bir muamele (örneğin, antijenik uyarımı) için çoğaltır. PBS içinde fare anti-sığır, IFN-γ, antikor (MCA2112, klon CC330) (8 ug / ml) seyreltilmesiyle yakalama antikoru çözelti hazırlayın. Bir çok kanallı pipet kullanarak 1 dakika boyunca / kuyu% 35 etanol 15 ul ELISPOT plaka kuyuları önceden ıslatın. Membran hasar görmesini önlemek için, tahlil sırasında herhangi bir noktada pipet uçları ile kuyuların dibine dokunmayın. Plakayı PBS içinde 300 ul / oyuk ile altı kez. Yıkama sıvısı plaka tersine çevirerek atılmalıdır. Yıkama plaka kuyuları kurumasına izin vermiyor, hızla yapılmalıdır. (Kademe 1 ile elde edilmiş) yakalama, anti-IFN-γ antikorun pipetle 100 ul / oyuk. 4 ° CO / N (bir fermuarlı saklama torbasına içinde plaka tutmak) inkübe. (Gün iki (uzun süreli kültür protokolünün 13. gün)) Iki nihai konsantrasyonda antijen çözümler hazırlayın. Tedaviler şunlardır: Hiçbir uyarım (cRPMI) PPD-B (20 ug / ml, nihai konsantrasyon: 10 ug / ml), TB10.4 protein kokteyli ve Ag85A (her protein 2 ug / ml, nihai konsantrasyon: 1 ug / Her bir protein mi), RESAT-6: CFP10 (M bovis enfeksiyonuna, 2 ug / ml, son konsantrasyon için iyi: örneğin pokeweed (20 ug / ml son konsantrasyon olarak 1 ug / ml) ve bir pozitif kontrol: 10 | ig / ml) eklenmiştir. Diğer mitojen yerine (örneğin, Concanavalin A) PWM kullanılabilmektedir. NOT: Bu adım için antijenler dört farklı tedaviler oluşturmak ve nOt (adım 2.5 gibi), bir havuz kullanılmıştır. Dört tedaviler: NS, PPDb, protein kokteyli (TB10.4 ve Ag85A tek tedavi oluşturan) ve PWM. 4. Kısa vadeli Hücre Kültürü ve Yapışkan Hücre (APC) İzolasyon (Altı: Uzun süreli kültür, 14 günlük protokolü) 1. gün kan aynı hayvanlardan 60 ml kan toplayın ve daha önce olduğu gibi PBMC'leri izole. 2 x 10 6 hücre / ml hücre konsantrasyonunu ayarlayın. Hücreleri kaplama yaparken Etiket tüpleri açıkça yanlış tahsisine yol önlemek için. Bu hücreler olarak kısa süreli hücre kültürü (6.5 adım) da ZPT izolasyonu için kullanılan ve yapılacaktır. Hayvan sayısı ve (: ex vivo, kısa vadeli veya taze hücreler bu durumda) kültür tipi hem Etiket tüpleri. Plaka tersine çevirerek ELISPOT aşırı yakalama antikoru çıkarın. Plakaları 300 ul PBST ile 6 kez yıkayın. Mümkün olduğu kadar PBST çıkarın. Pipet, uzun vadeli hücre ve APC 'olarak adlandırılan oyuklara hücre süspansiyonları 50 ul. Blok diğer welcRPMI 200 ul / oyuk ile ls. 90 dakika ya da 39 ° C inkübe Ön ılık cRPMI veya 39 ° C (daha sonraki adımlar için gerekli). Yapışık hücre (APC 'ler) izolasyonu için kullanılmadığı taze PBMC sonraki aşamalarda gerekli olacak ve saklanmalıdır. 5. Kültür Hücreler 90 dakika inkübasyon (adım 4.4, kısa vadeli kültürü ve yapışık hücre izolasyonu adım), hasat, uzun vadeli kültürlü hücrelerde sırasında. Yukarı ve aşağı hücreleri ile 5 veya 10 ul pipet, pipet medya kullanılarak dörtlü tek bir 15 ml tüp içine her hayvandan çoğaltır birleştirmek, hücreleri ayırmak için. 400 g'de 5 dakika boyunca tüpler santrifüjleyin. Santrifüj işleminden sonra tüp tersine çevirerek süpernatant atın. Hücre pelet çıkarmak. Gerekirse hafifçe pelet yeniden askıya PBS 5 ml ekleyin. Santrifüj tekrarlayın. Iki kez yıkama adımı yineleyin. 1ml cRPMI hücreleri askıya yeniden hafifçe tüp tersine çevirerek Süpernatantı atın ve. Hücre konsantrasyonunu ayarlayın2 x 10 5 hücre / ml. 6. Kaplama Taze ve Kültür PBMC'leri 90 dakika inkübasyondan sonra, 30 saniye için plaka çalkalayıcısı üzerinde çalkalayın. Plaka ters yıkanarak yapışmayan hücreler çıkarın. Pipet 150 ul / sıcak cRPMI iyi (altında 4. adımda, gelen: Kısa vadeli hücreleri ve yapışık hücre (APC) izolasyon adımı). Plakaları çalkalayın ve yıkama sıvısı atın. Tekrarlayın yıkama 3 kez. 100 ul / oyuk, uygun kuyulara her bir antijen ekle (ön-etiketli). Hücreleri kaplamak için, uzun vadeli bir hücre ve APC 'etiketli kuyu içine pipetle 100 ul / oyuk uzun süreli kültürlenmiş hücre süspansiyonu (2 x 10 5 hücre / ml). APC iyi zaten olduğu gibi bu aşamada eklenen uzun vadeli hücreleri aynı hayvandan emin olun. Farklı hayvanlardan APC en uzun vadeli kültür hücreleri karıştırmayın. APC olmayan kuyulara uzun süreli kültürlenmiş hücre süspansiyonu pipetle 100 ul / oyuk (2 x 10 5 hücre / ml)Uzun vadeli kültür yanıt APC ihtiyacının değerlendirilmesi için s. 100 ul / kuyucuk kısa süreli hücreleri (yeni izole edilmiş ve 2 x 10 6 hücre / ml olacak şekilde ayarlandı) ex vivo müdahale değerlendirilmesi için ekleyin. 39 ° C /% 5 CO 2 inkübatör plakaları O / N inkübe edin. Plakalar düz yalan olduğundan emin olun ve plakaları yığını yok. Not: Hücre fenotipinin analiz isteniyorsa, akış sitometrisi, bir yan deneyi olarak gerçekleştirilebilir. Hücreler, ELISPOT deneyi için tarif edildiği gibi 96 oyuklu U tabanlı bir plakanın (yerine ELISPOT plakaları) kaplanır. Yakalama antikor adsorpsiyon (3,4-3,5 adımları) atlanır edilmelidir. Hücreler daha sonra 39 ° C /% 5 CO2 ve uygulanan standart hücre boyama protokolü O / N inkübe edilir. Hücre boyama reaktifleri reaktifler tabloya dahil edilmiştir. Gün üç (Uzun süreli kültür protokolünün 14. gün) Algılama antikoru (fare anti-sığır, IFN-γ, klon CC3 seyreltilir02) PBS% 1 BSA içinde 5 ug / ml. Kuyu sıvı atılır ve plakalar yıkama: ek bir 6 kez önce ve aradaki yıkamalar, bir kez dH 2 O (300 ul / göz) ile 10 saniye boyunca karıştırma cihazı üzerinde, her yerleştirme altı kez PBST ile (300 ul / kuyucuk), PBS ile PBST ile (300 ul / göz) ve iki kez (300 ul / oyuk). Hücreler plakalardan kaldırıldıktan sonra hiçbir biyogüvenlik endişeleri uygularsanız, ve, prosedürler, biyolojik güvenlik kabinleri dışında yapılabilir. Atın yıkama sıvısı. Kağıt havlu üzerine plakayı dokunarak mümkün olduğu kadar yıkama sıvısı çıkarın. Algılama antikor ekleyin (100 ul / oyuk). 120 dakika ya da 39 ° C için inkübe Bu inkübasyon adımı sırasında, imalatçının talimatlarına uygun olarak alkali fosfataz solüsyon hazırlanır. Kullanmadan önce otuz dakika (örneğin, oyuklara algılama antikoru ilave edildikten sonra 90 dakika) PBST içinde reaktif seyreltin. Reaktifler karıştırın ve oda sıcaklığında kuluçkaya hafifçe Tüpü ters çevirin. 12 sonrası0 dakika inkübasyon, plaka ters aşırı algılama antikoru atın. Plakayı PBST ile 6 kez (300 ul / oyuk). Kağıt havlu üzerine plakayı dokunarak mümkün olduğu kadar yıkama sıvısı çıkarın. 100 ul / oyuk (aşama 3 ile elde edilmiş), alkalin fosfataz çözeltisi ekleyin. Oda sıcaklığında 45 dakika boyunca inkübe edin. Sıvı atın ve PBST ile her bir levha 6 kez yıkayın (300 ul / oyuk). Üreticinin talimatlarına (Vector Blue AP alt-tabaka III) alt-tabaka çözeltisi hazırlayın: 100 mM Tris HCI pH 8.2 tampon maddesi içinde reaktifleri ile seyreltilir. Pipet 50 ul / alt-tabaka çözeltisi de. Mavi renk (yaklaşık 30 dakika) gelişmeye başlar kadar oda sıcaklığında inkübe edin. Sıvı atın ve dH 2 O. bol miktarda tabakları yıkamak , Membran maruz geri kuyu yıkama ve kuru hava plaka izin alt plakasını sökün. Stereomikroskopta kullanarak elle immünospot görüntü analizörü veya ELISPOT okuyucu (Tablo 1), ya da plakaları okuyun. Alternatif olarak, tabak tutmakokumaya erişilene kadar oda sıcaklığında karanlıkta. Çünkü Reaksiyon alt tabakanın, yüksek stabilite, kalitesi birkaç yıl boyunca korunur. NOT: Hücreler ve antijen konsantrasyonları sayılamayan noktalar 23,24,27,37 ile kuyu önlemek için optimize edilmiştir. Bu sayılamayan noktalar oluşumu farklı ortamlarda veya bağlı biyolojik çeşitliliği meydana mümkündür. Bu durumda okunabilir nokta sayma tepkisi elde edilir, böylece hücre konsantrasyonu optimize edilmelidir. 7. Plakalar Okuma ve Veri Analizi Hücresel Teknoloji Limited (CTL) ELISPOT plaka okuyucu kılavuzuna (Tablo 1) göre analiz gerçekleştirin. Noktalar sayımları oyuktan her biri için elde edildikten sonra, çiftleri arasındaki ortalama hesaplamak. her bir antijenik uyarıya spesifik immün yanıt antijen uyarımlı kuyu bu olmayan stimüle kuyularda lekelerin ortalama sayısı çıkarılarak hesaplanır.

Representative Results

M. ile yaklaşık bir aylık post-aerosol enfeksiyonu bovis (10 4 koloni oluşturan birim), PBMC'ler enfekte (n = 8) ve kontrol hayvanları (n = 8) antijen ve 13 gün boyunca IL-2 mevcudiyetinde kültürlenmiştir. TCM yanıtlarının gelişimi enfeksiyondan sonra, IFN-γ ELISPOT deneyi kullanılarak belirlendi. (APC 'varlığında veya yokluğunda) Örnek TCM ve ex vivo IFN-γ, Şekil 1' de gösterilmiştir, enfekte hayvanların (üç hayvan) ve enfekte olmayan bir hayvan (bir hayvan) ile ilgili ELISPOT yanıtlar. Başarılı bir uzun dönemli, IFN-γ IFN-γ üreten hücrelerinde ELISPOT testi sonuçları uyarılmış koşullar altında ve enfekte olmayan hayvanlardan yanıt verilmemesi halinde yakın ve uyarılmamış koşullar altında (Noktası-oluşturan hücreler, SFC). Ayrıca, güçlü bir T-hücresi yanıtı PWM'ye cevaben gerçekleşmelidir. M. Özgü tepkiler CFP10 antijenik uyarımı: bovis PPD-B ya da RESAT-6 ile değerlendirildi. Şekilde gösterildiği gibi,1, sağlam TCM ve eski PPD-B ve Reşat-6 vivo yanıtları: CFP10 her üç M. gelen saptandı bovis hayvanları ile enfekte. Hiçbir TCM ve ex vivo yanıtları Minimal kontrol hayvandan saptandı. Otolog APC 'lerin yokluğunda kültürlenen uzun süreli hücreler tarafından büyük ölçüde azaltılmış yanıtları ile gösterildiği gibi aynı zamanda, APC' lerin varlığı, enfekte olmuş hayvanlar tarafından iyi TCM cevapları için gerekli oldu. M. PBMC'ler tarafından IFN-γ yanıtı bovis enfekte olan ve olmayan enfekte edilmiş hayvanları, Şekil 2'de sunulmaktadır. her hayvandan SFC'leri sayısı PPD-B eksi tek başına ortam için ilgili yanıt yanıt olarak, ikili örneklerde SFC'leri ortalama sayısı olarak hesaplanmıştır. Tepkiler 10 6 hücreleri için tahmin edilmiştir. Farklılık Yanıtlar (p <0.05) enfeksiyonu durumu varlığında veya APC 've Kültür süresi (yani., Uzun dönemli kültür karşı ex vivo kültür) yokluğunda dayalı. <table border="0" cellpadding = "0" cellspacing = "0"> Plakaların imajını Kazanılması 1. Makineyi açın 2. Aç "Immuno Capture" Version 6.3 yazılımı. 3. Adım 1: select plaka tipi. 4. Adım 2: yük plakası. 5. Adım 3: tarama seçeneklerini belirleyin. 6. Adım 4: Tarama işlemini başlatmak. 7. Plaka genel görüntü elde. 8. Plaka çıkarın. 9. "Immuno Yakalama" yazılımını çıkın. Spot oluşturan birimler Sayma 1. "Bağışıklık Nokta Yakalama" Version 5.0 yazılımını açın. 2. Seçin hedeflere t tipi: Normal. 3. Seçin sayma modülü: akıllı sayım. 4. 1. Adım: yük plakası. 5. Adım 2: sayım parametreleri tanımlayın: Spot tanıma testi doğruluğu farklı noktalar ile kuyularda. 6. Otomatik sayısını başlatın. Kalite kontrol 1. Aç "immünospot Capture" Version 5.0 yazılımı. 2. Seçin sayma modülü: kalite kontrol. 3. 1. Adım: yük plakası. 4. Adım 2: bireysel vurgulanan kuyular analiz edin. 5. Kalite kontrolünü bitirin. Tablo 1 – otoimmun Diagnostika ELISPOT okuyucu görüntü toplama ve hücre prosedürü sayma. ove_content "fo: keep-together.within sayfa =" always "> ELISPOT testi γ uzun vadeli kültürlenmiş IFN-y ile ilgili oyuklara Şekil 1. Görüntü. Kültürlenmiş IFN-γ ELISPOT testi virülan M ile yüklemeden sonra approximatelyone ayda gerçekleştirilmiştir bovis (üç hayvan). Enfekte olmayan hayvanların kontrol (bir hayvan) olarak alındı ​​uzun vadeli yeniden birleştirici hücre çizgileri Ag85A (1 ug / ml), TB10.4 (1 ug / ml) bir kokteyli ile PBMC'nin uyarılması tarafından oluşturulan, RESAT-6.: CFP10 (1 ug / ml) ve bunların PPD-B otolog APC varlığında veya yokluğunda, ELISPOT plakalarına transferi ve ardından 13 gün süreyle (5 ug / ml). PBMC günde 13 izole ELISPOT plakalarına doğrudan kaplama kısa vadeli hücreleri oluşmuştur. Uzun dönem ve kısa dönem hücrelerinin PPD-B (10 ug / ml), RESAT-6 ile uyarıldı: 5 (CFP10 (1 ug / ml), tek başına ortam veya pokeweed mitojen ve# 956 g / mi) 24 saat karıştırıldı. M. ELISPOT yanıt γ uzun vadeli kültürlü IFN gelen Şekil 2. Temsilcisi sonuçları bovis saflaştırılmış protein türevi (PPD-B). Kültürlenmiş IFN-γELISPOT deney virülan M ile yüklemeden sonra approximatelyone ayda gerçekleştirilmiştir bovis (sekiz hayvanlar). Enfekte olmayan hayvanların Sekiz hayvan uzun süreli hücreler, rekombinant Ag85A bir kokteyli (1 ug / ml), TB10.4 (1 ug / ml) ile PBMC'nin uyararak elde edildi (kontrol olarak dahil edildi RESAT-6: CFP10 (1 ug / ml) ve bunların PPD-B otolog APC 'lerin varlığı veya yokluğunda, ELISPOT plakalarına transferi ve ardından 13 gün süreyle (5 ug / ml). Kısa vadeli hücreleri PBMC oluşuyordu günde 13 izole edilmiş ve ELISPOT plakasına doğrudan kaplamalı . Uzun vadeli ve shooda sıcaklığı süreli hücreleri tek başına, 24 saat boyunca PPD-B (10 ug / ml) ya da ortam ile uyarıldı. Her bir hayvan (SFC / 10 6 hücre) için spesifik yanıtların PPD-B (kopya halindeki numunelerin ortalamasını) eksi tek başına ortam tepki tepki olarak sunulmaktadır.

Discussion

Uzun vadeli kültürlü ELISPOT deneyleri IFN-γ üretim insanlarda TCM genellikle nedeniyle, ancak bu yanıt kültüründe nasıl geliştiği tam olarak anlaşılamamıştır. İster Tcm dolaşımda bulunan ve in vitro genişletmek veya TCM yanıtları kültür sırasında TCM içine efektör ve Tem hücrelerin farklılaşması sonucu ise bilinmemektedir. Bununla birlikte, insanlar örnekler ile yapılan çalışmalar, ex vivo ve uzun vadeli kültürlenmiş, IFN-γ ELISPOT deneyleri CD4 + T hücreleri, TCM yanıtları efektör hücreler 28 gelişir yok olduğunu ima ilişkisiz epitop özgüllükleri sahip olduğunu bulmuşlardır. Açıkçası, cevap süresi değişebilir, ancak patojen açıklık elde edilir ise, sonuçta hem ex vivo ve TCM yanıtları düşüş. Ayrıca, uzun süreli kültürleri yanıtları erken ve geç antijen prime sonra ölçülen (efektör tepkisi daha düşük olduğunda) gösteren ilişkili olduğu gösterilmiştir, anti sonra erken ve uzun TCM popülasyonları dolaşımgen hazırlama in vivo ilgili kalır. Öte yandan, ex vivo olarak tepkinin büyüklüğü hafıza yanıtının 29 büyüklüğü ile ilgili olarak görünmemektedir. Bu sonuçlar, uzun dönemli kültür IFN-γ ELISPOT yanıtları TCM in vitro genişlemesi ve numunedeki efektör tepkilerinin ilişkili bir azalmasından yerine TCM fenotip efektör hücrelerin farklılaşması sonucu olduğunu düşündürmektedir.

Sığır ile, uzun vadeli bir IFN-γ ELISPOT deneyleri ile tespit tepkiler efektör bellek alt nispi katkısı bilinmemektedir. Son çalışmalar aşı arasında bir korelasyon M. ile müteakip deneysel enfeksiyona karşı uzun vadeli kültürlü IFN-γ ELISPOT yanıtları ve koruma elicited gösteriyor bovis 23-24. Bu aşı, zayıf, uzun vadeli, IFN-γ ELISPOT yanıtları koruma 30 yokluğu ile ilişkili olduğu bildirilmiştir. Hem canlı ve öldürmeked aşılar benzer ex vivo IFN-γ ELISPOT yanıtları neden, ama canlı BCG ile aşılama öldürdü aşı hazırlıkları yapmak daha güçlü, uzun vadeli kültürlü IFN-γ ELISPOT yanıtları ortaya çıkarır. Öldürülen formülasyonlar öldürücü tüberküloz mikobakteriler 31-32, 33 ile meydan karşı koruma sağlamak için başarısız olurken İlginçtir, canlı aşılar koruyucu.

TCM yanıtlarının değerlendirilmesi de PBMC'den bu hücrelerin sıralayarak mümkündür. PBMC'den TCM Doğrudan zenginleştirme, ancak, son derece kişisel eğitimli pahalı cihazları gerektirir ve bu hücreler, kan akışında çok değil gibi zordur. PBMC Uzun süreli kültür TEM ve pahalı cihazlar olmadan efektör hücrelerin üzerinde TCM zenginleşmesine sağlar; Bu T hücre popülasyonlarının in vitro genişletilmiş Ancak, in vivo bellek karşılıkları daha az temsil ediyor olabilir. Bu uzun vadeli bir kültür veya TCM sıralama kullanarak (IFN-γ hafıza yanıtları ulaşmak mümkündürsitokin ELISA 34, sitokin kordon diziler (CBA), hücre içi boyama (ICS), veya sitokin protein dizinlerinin (CPA), örneğin: ELISPOT dışında deneyleri ile stratejiler) ing. Bu yöntem; Bununla birlikte, genellikle, ELISPOT 35 deneylerden daha az duyarlıdır.

ELISPOT bir avantajı kısa bir süre salma diğer hücrelere enzimatik yarılma veya sitokin emme kuvvetiyle yüzücüye ve parçalanmasında seyreltme önlenmesi sonra sitokin hemen yakalama tespit yeteneğidir. ELISPOT deneyleri bile gürültü senaryolar (yani, düşük özgül tepkiler) 35 düşük sinyalde kesin sonuçlar veren sitokin üreten tek hücreleri tespit. Ayrıca, ICS ile, serbest bırakmak için önceden sitokinlerin tespit sitokinleri üreten hücrelerin sahte tanımlama neden olabilir (örn., Bağlı salgılama işlemi sırasında veya öncesinde, post-translasyonel modülasyonu) 34. sitokin salgılanmasını en aza indirmek için ICS deneylerinin birlikte kullanılabilir iletim inhibitörlerinin(Golgi durdurma proteinleri olarak da bilinir) antijen uyarımı esnasında nedeniyle sonuçta sitokin üretimini 35 etkileyen bu proteinlerin hücre toksisitesine hücre uyarımı süresini sınırlamak.

Bu bahsedilen birlikte – (., Yani ICS) CBA, CPA ve ICS ve / veya hücre yüzey işaretleyici ifade saptanması için aynı anda birden fazla sitokinleri ölçmek için yararlı bir teknik vardır. Bu nedenle, bu yöntemler, IFN-γ, ELISPOT deneyi 36 ile kombinasyon halinde de kullanılabilir. Önceki sığır TB aşı etkinliği çalışmaları ELISPOT testi aracılığıyla TCM yanıtları ölçülen ederken, diğer tekniklerle TCM tepkilerinin tespiti karşılaştırılabilir sonuçlar büyük olasılıkla verecektir. Önemli olarak, ELISPOT testi daha az pahalı ve FMA, CPA ve ICS analiz teknikleri 34 daha gerçekleştirmek için daha kolaydır. SFC Manuel sayma otomatik sayım bir alternatiftir ve ELISPOT plakalar önce veya nokta c sonra, en az kalite kaybı ile uzun süre boyunca oda sıcaklığında muhafaza edilebilir37 tutarlı.

Uzun süreli kültürlenmiş IFN-γ ELISPOT yanıtı tüberküloz aşısı yanıtları değerlendirilerek bellek insan tarafından yanıtları ve sığır değerlendirmek için uygulanmıştır 14-16,31-32,33. . TCM yanıtları da örneğin, sığır birçok enfeksiyon maddeleri, ev sahibi yanıtlarında önemli roller oynadığı kabul edilmektedir: Mycoplasma mycoides subsp mycoides 42, Anaplasma 38 ve sığıra ait solunum sistemi sinsitiyal virüsü 39 marginale. Potansiyel olarak, uzun dönem ELISPOT testi diğer hayvan türleri, sitokinler ve enfeksiyon için adapte edilebilir. Bunlar geniş uygulamalar nedeniyle belirli reaktif akım sınırlı kullanılabilirliği veteriner immünoloji uygulamaları için özellikle yararlı olacaktır.

TCM yanıtları birkaç enfeksiyonlarına karşı koruma için çok önemlidir, ancak ma (hastalık sonucu tahmin veya aşı etkinliği için) enfeksiyonu / aşılamadan sonra onları erken ölçümy hantal. Ex vivo olarak, kısa antijenik uyarımı koşullar altında bağışıklık tepkisinin analizi ile daha sık, özellikle immünolojik hafıza oluşumunun başlangıcı sırasında, bağlı bellek efektör tepkilerinin örtüşmeye efektör tepkilerini temsil etmektedir. Antijen yükü sürekli olan kronik hastalıklar çerçevesinde, ex vivo olarak cevaplar efektör hücre yanıtları veya bellek efektör hücre yanıtlarının bir arada değerlendirecektir. Uzun süreli kültürlenmiş IFN-γ ELISPOT deneyi, büyük olasılıkla TCM yanıtları yerine efektör T hücresi veya bir araya CD4 + T hücre yanıtlarının ölçümünü sağlar, burada açıklanan. Özet olarak, uzun dönem kültürlenmiş IFN-γ ELISPOT testi T hücre bellek karşılıkları tahmin etmek için değerli bir yaklaşım sağlar ve enfeksiyonlar ajanlar çeşitli birçok türün bellek tepkilerini ölçmek için başanlı bir şekilde kullanılmıştır 12-16, 20-25,29 , 31,33,34,38,39.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

3625-32000-104 Tarım ve Gıda Araştırma Girişimi Rekabetçi Hibe no: Araştırma USDA, ARS Cris tarafından desteklenmiştir. Gıda ve Tarım USDA Ulusal Enstitüsü 2011-67015-30736. Biz Jessica Pollock, Emma Frimml-Morgan, Shelly Zimmerman, Kristin Bass, Bruce Pesch, Molly Stafne, Allen Jensen ve Tracy Porter mükemmel teknik yardım için yanı sıra Rebecca Madison, Doug Ewing, Katie Pille Jay Steffen, David Lubbers teşekkür hayvanların mükemmel bakım ve kullanım için Robin Zeisness ve David Panthen.

Materials

Sodium citrate (dihydrate) Various
Citric acid (monohydrate) Various
Dextrose Various
ELISPOT PVDF plate Various
Vectastain ABC – AP KIT Standard Vector Laboratories AK-5000
Vector Blue Alkaline Phosphatase Substrate Kit Vector Laboratories SK-5300
Ag85A Lionex LRP-0004.3 23, 24, 25, 37
TB 10.4 Lionex LRP-0061.6 23, 24, 25, 37
PPDb Prionics AG 7600055
rESAT-6:CFP10 Kind gift Dr. Minion, Iastate 23, 24, 25, 27,  37
Mouse anti-bovine IFN-γ Clone CC302 Serotec MCA1783B 23, 24, 25, 27,  37
Mouse anti-bovine IFN-γ Biotinylated Clone CC330 Serotec MCA2112 23, 24, 25, 27,  37
Mouse anti-bovine CD4 Clone CC8 Serotec MCA1653GA
Mouse anti-bovine CD45RO Clone IL116A Serotec MCA2434GA
Rat anti-human CCR7 Clone 3D12 Abcam ab95665
Mouse anti-bovine IFN-γ-Pe Clone CC302 Serotec MCA1783PE
Goat anti- mouse IgG2a- Alexa Fluor 350 Invitrogen A-21130
Goat anti-mouse IgG3 APC-CY7 SouthernBiotechnology 1080-193
Goat anti-rat IgG-APC Invitrogen A10540
BD Cytofix/Cytoperm™ BD Biosciences 554714
BrefeldinA Sigma-Aldrich B7651
Pokeweed Mitogen Sigma-Aldrich L8777
Recombinat human Interleukin 2 Sigma-Aldrich I7908
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Szabo, S. J., Kim, S. T., Costa, G. L., Zhang, X., Fathman, C. G., et al. Novel transcription factor, T-bet, directs Th1 lineage commitment. Cell. 100 (6), 655-669 (2000).
  2. Mullen, A. C., High, F. A., Hutchins, A. S., Lee, H. W., Villarino, A. V., et al. Role of T-bet in commitment of Th1 cells before IL-12-dependent selection. Science Signaling. 292 (5523), 1907 (2001).
  3. Mosmann, T. R., Cherwinski, H., Bond, M. W., Giedlin, M. A., Coffman, R. L. Two types of murine helper T cell clone. I. Definition according to profiles of lymphokine activities and secreted proteins. Journal of immunology. 136 (7), 2348-2357 (1986).
  4. Lighvani, A. A., Frucht, D. M., Jankovic, D., Yamane, H., Aliberti, J., et al. T-bet is rapidly induced by interferon-gamma in lymphoid and myeloid cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (26), 15137-15142 (2001).
  5. Masopust, D., Picker, L. J. Hidden memories: frontline memory T cells and early pathogen interception. Journal of immunology. 188 (12), 5811-5817 (2012).
  6. Sallusto, F., Lenig, D., Förster, R., Lipp, M., Lanzavecchia, A. Two subsets of memory T lymphocytes with distinct homing potentials and effector functions. Nature. 401 (6754), 708-712 (1999).
  7. Waters, W. R., Palmer, M. V., Thacker, T. C., Davis, W. C., Sreevatsan, S., et al. Tuberculosis immunity: Opportunities from studies with Cattle. Clinical and Developmental Immunology. 2011 (1), 1-11 (2011).
  8. Whelan, A. O., Villarreal-Ramos, B., Vordermeier, H. M., Hogarth, P. J. Development of an antibody to bovine IL-2 reveals multifunctional CD4 T(EM) cells in cattle naturally infected with bovine tuberculosis. PLoS ONE. 6 (12), e29194 (2011).
  9. Streitz, M., Tesfa, L., Yildirim, V., Yahyazadeh, A., Ulrichs, T., et al. Loss of receptor on tuberculin-reactive T-cells marks active pulmonary tuberculosis. PLoS ONE. 2 (8), e735 (2007).
  10. Soares, A. P., Scriba, T. J., Joseph, S., Harbacheuski, R., Murray, R. A., et al. Bacillus Calmette-Guérin vaccination of human newborns induces T cells with complex cytokine and phenotypic profiles. Journal of immunology. 180, 3569-3577 (2008).
  11. Waters, W. R., Palmer, M. V., Buddle, B. M., Vordermeier, H. M. Bovine tuberculosis vaccine research: historical perspectives and recent advances. Vaccine. 30 (16), 2611-2622 (2012).
  12. Letvin, N. L., Mascola, J. R., Sun, Y., Gorgone, D. A., Buzby, A. P., et al. Preserved CD4+ central memory T cells and survival in vaccinated SIV-challenged monkeys. Science. 312 (5779), 1530-1533 (2006).
  13. Mattapallil, J. J., Douek, D. C., Buckler-White, A., Montefiori, D., Letvin, N. L., et al. Vaccination preserves CD4 memory T cells during acute simian immunodeficiency virus challenge. The Journal of experimental medicine. 203 (6), 1533-1541 (2006).
  14. Lindenstrom, T., Knudsen, N. P. H., Agger, E. M., Andersen, P. Control of Chronic Mycobacterium tuberculosis .infection by CD4 KLRG1- IL-2-secreting central memory cells. The Journal of Immunology. 190 (12), 6311-6319 (2013).
  15. Todryk, S. M., Bejon, P., Mwangi, T., Plebanski, M., Urban, B., et al. Correlation of memory T cell responses against TRAP with protection from clinical malaria, and CD4 CD25 high T cells with susceptibility in Kenyans. PLoS ONE. 3 (4), e2027 (2008).
  16. Webster, D. P., Dunachie, S., Vuola, J. M., Berthoud, T., Keating, S., et al. Enhanced T cell-mediated protection against malaria in human challenges by using the recombinant poxviruses FP9 and modified vaccinia virus Ankara. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (13), 4836-4841 (2005).
  17. Rie, A., Warren, R., Richardson, M., Victor, T. C., Gie, R. P., et al. Exogenous reinfection as a cause of recurrent tuberculosis after curative treatment. New England Journal of Medicine. 341 (16), 1174-1179 (1999).
  18. Caminero, J. A., Pena, M. J., Campos-Herrero, M. I., Rodríguez, J. C., Afonso, O., et al. Exogenous reinfection with tuberculosis on a European Island with a moderate incidence of disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 163 (3), 717-720 (2001).
  19. Sallusto, F., Lanzavecchia, A., Araki, K., Ahmed, R. From vaccines to memory and back. Immunity. 33 (4), 451-463 (2010).
  20. Millington, K. A., Gooding, S., Hinks, T. S. C., Reynolds, D. J. M., Lalvani, A. Mycobacterium tuberculosis.-specific cellular immune profiles suggest bacillary persistence decades after spontaneous cure in untreated tuberculosis. The Journal of infectious diseases. 202 (11), 1685-1689 (2010).
  21. Su, L. F., Kidd, B. A., Han, A., Kotzin, J. J., Davis, M. M. Virus-specific CD4(+) memory-phenotype T cells are abundant in unexposed adults. Immunity. 38 (2), 373-383 (2013).
  22. Goletti, D., Butera, O., Bizzoni, F., Casetti, R., Girardi, E., Poccia, F. Region of difference 1 antigen-specific CD4+ memory T cells correlate with a favorable outcome of tuberculosis. The Journal of infectious diseases. 194 (7), 984-992 (2006).
  23. Waters, W. R., et al. Efficacy and immunogenicity of Mycobacterium bovis. DeltaRD1 against aerosol M. bovis. infection in neonatal calves. Vaccine. 27 (8), 1201-1209 (2009).
  24. Hope, J. C., et al. Identification of surrogates and correlates of protection in protective immunity against Mycobacterium bovis. infection induced in neonatal calves by vaccination with M. bovis. BCG Pasteur and M. bovis. BCG Danish. Clinical and Vaccine Immunology. 18 (3), 373-379 (2011).
  25. Thom, M. L., et al. Duration of immunity against Mycobacterium bovis. following neonatal vaccination with bacillus Calmette-Guérin Danish: significant protection against infection at 12, but not 24, months. Clinical and Vaccine Immunology. 19 (8), 1254-1260 (2012).
  26. Aabye, M. G., Ravn, P., Johansen, I. S., Eugen-Olsen, J., Ruhwald, M. Incubation of whole blood at 39°C augments gamma interferon (IFN-γ)-induced protein 10 and IFN-γ responses to Mycobacterium tuberculosis .antigens. Clinical and vaccine immunology : CVI. 18 (7), 1150-1156 (2011).
  27. Maue, A. C., Waters, W. R., Davis, W. C., Palmer, M. V., Minion, F. C., Estes, D. M. Analysis of immune responses directed toward a recombinant early secretory antigenic target six-kilodalton protein-culture filtrate protein 10 fusion protein in Mycobacterium bovis.-infected cattle. Infection and Immunity. 73 (10), 6659-6667 (2005).
  28. Godkin, A. J., Thomas, H. C., Openshaw, P. J. Evolution of epitope-specific memory CD4(+) T cells after clearance of hepatitis C virus. Journal of immunology. 169 (4), 2210-2214 (2002).
  29. Todryk, S. M., et al. The relationship between human effector and memory T cells measured by ex vivo and cultured ELISPOT following recent and distal priming. Immunology. 128 (1), 83-91 (2009).
  30. Vordermeier, H. M., et al. Viral booster vaccines improve Mycobacterium bovis. BCG-induced protection against bovine tuberculosis. Infection and Immunity. 77 (8), 3364-3373 (2009).
  31. Orme, I. M. Induction of nonspecific acquired resistance and delayed-type hypersensitivity, but not specific acquired resistance in mice inoculated with killed mycobacterial vaccines. Infect. Immun. 56 (12), 3310-3312 (1988).
  32. Griffin, J. F., Mackintosh, C. G., Slobbe, L., Thomson, A. J., Buchan, G. S. Vaccine protocols to optimise the protective efficacy of BCG. Tubercle and lung disease : the official journal of the International Union against Tuberculosis and Lung Disease. 79 (3), 135-143 (1999).
  33. Buddle, B. M., et al. Protection of cattle from bovine tuberculosis by vaccination with BCG by the respiratory or subcutaneous route, but not by vaccination with killed Mycobacterium vaccae.. Research in veterinary science. 59 (1), 10-16 (1995).
  34. Lehmann, P. V., Zhang, W. Unique strengths of ELISPOT for T cell diagnostics. Methods in Molecular Biology. 792 (Chapter 1), 3-23 (2011).
  35. Tincati, C., Iii, A. J. C., Snyder-Cappione, J. E. Distinguishing latent from active Mycobacterium tuberculosis. infection using Elispot assays: looking beyond interferon-gamma). Cells. 1 (2), 99-99 (2012).
  36. Lash, G. E., Pinto, L. A. Multiplex cytokine analysis technologies. Expert review of vaccines. 9 (10), 1231-1237 (2010).
  37. Vordermeier, M., Whelan, A. O. ELISPOT assays to enumerate bovine IFN-γ-secreting cells for the development of novel vaccines against bovine tuberculosis. Methods in molecular biology. 792, 219-227 (2012).
  38. Han, S., Norimine, J., Palmer, G. H., Mwangi, W., Lahmers, K. K., Brown, W. C. Rapid deletion of antigen-specific CD4+ T cells following infection represents a strategy of immune evasion and persistence for Anaplasma marginale. Journal of immunology. 181 (11), 7759a-7769a (2008).
  39. Helden, M. J. G., et al. Pre-existing virus-specific CD8(+) T-cells provide protection against pneumovirus-induced disease in mice. Vaccine. 30 (45), 6382-6388 (2012).

Tags

Interferon-γELISPOT AssayEffector T CellsMemory T CellsCentral Memory T CellsEffector Memory T CellsCattleTuberculosisVaccinationAntigen StimulationLong-term Culture

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Maggioli, M. F., Palmer, M. V., Vordermeier, H. M., Whelan, A. O., Fosse, J. M., Nonnecke, B. J., Waters, W. R. Application of Long-term cultured Interferon-γ Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle. J. Vis. Exp. (101), e52833, doi:10.3791/52833 (2015).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image