העכבר נאיבי CD4<sup> +</supו> בידוד תא T<em> במבחנה</em> בידול לתוך תת תא T
Summary
Naïve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of naïve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.
Abstract
Antigen inexperienced (naïve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a naïve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during naïve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of naïve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing naïve cells to various T helper effector lineages in vitro.
Introduction
הרעיון של שושלות או תת קבוצות של עוזר CD4 + T מובחנים תאים (ה ') כבר בסביבות מאז שלהי המאה ה -20 1. הכרה של אנטיגן המקור בנוכחות תוצאות אותות costimulatory בכמה סבבים של התרבות תאים וההתמיינות הסופית למפעיל Th תאים. סוג Th תא שנוצר במהלך תהליך זה תלוי בסביבת ציטוקינים נוכחת במהלך ההפעלה 2. בתחילה, תאי Th נאיביים נחשבו ללקטב לתוך 2 שושלות שונות הבאים קולט תא T הפעלה (TCR), קשירת CD28 costimulatory, ואיתות ציטוקינים. תאים מסוג 1 עוזר (Th1) מתאפיינים בייצור שלהם מפעיל של ציטוקינים IFNγ כמו גם הדרישה שלהם לאיתות IL-12 במהלך 3,4 תהליך ההתמיינות. סופו של דבר התברר שיש לי תאי Th1 מובחנים פרופיל גנטי שמאופיין ב מובהק ביותרy הביטוי של גורם שעתוק משפחת תיבת T, Tbx21 (T-הימור), הנחשב לרגולטור הראשי של התכנית הגנטית Th1 5. יתר על כן, IL-12, כמו גם IFNγ יכול לקדם את ביטוי T-הימור 6,7. בתגובה החיסונית, תאי Th1 חשובים להגנה מפני פתוגנים המארח תאיים, כמו גם יזמים חזקים של דלקת אוטואימונית. בניגוד לכך, תאים מסוג 2 עוזר (Th2) דורשים IL-4 לפיתוחם וציטוקינים מפעיל שלהם, כולל IL-4, IL-5, ו- IL-13, הם חשובים לנהיגת תגובות תא B והם פתוגניים באלרגיה 8, 9. בדומה לתאי Th1, תאי Th2 נמצאו להביע רגולטור תעתיק הורים שלהם, כינה Gata-3 10,11. מעניין לציין, כי הנוכחות של ציטוקינים קיטוב והדור של שושלת Th ספציפית הם עוינות להתפתחותם של אחרים 2,12, המצביע על כך רק קבוצת משנה Th מסוימת עשויה להיות דומיננטית במהלך מחדש חיסוניsponse.
מאז זיהוי של שושלות Th1 וTh2, עבודה נוספת הוכיחה עוד יותר ייחודי תת קבוצות של תאי T helper, כוללים עוזר זקיקים (TFH), IL-9-ייצור (Th9), וIL-22-ייצור (Th22) (לאחרונה בביקורת ב- 13). לצורך ניסויי בידול במבחנה, פרוטוקול זה יתמקד רק בשני תת Th נוסף, המכונה תאי T רגולטורים (Treg) וIL-ייצור-17 תאי CD4 + T (TH17). CD25 + תאי T רגולטורים יכולים להתרחש באופן טבעי (nTreg) בבלוטת התימוס; תאי Th נאיביים יכולים להיות גם מושרה (iTreg) להפוך לרגולציה בפריפריה (שנסקרה ב14,15). שני הסוגים של Tregs להביע גורם שעתוק אופייני, כינה P3 forkhead התיבה (Foxp3), שהוא קריטי למנגנוני דיכוי מפעיל שלהם הכוללים ייצור אנטי דלקתי מסיס מתווך, IL-2 הצריכה, ותא מנגנוני קשר תלוי 14,15. חוסר Foxp3 תוצאות ביטוי בהפרעה אוטואימונית חמורה, רב-איבר כינו dysregulation חיסוני, polyendocrinopathy, enteropathy, תסמונת X-צמוד (אייפקס), הממחישה את התפקיד הקריטי של קבוצת משנה Th זה בפתרון דלקת והסדרת סובלנות היקפית לעצמי אנטיגנים 16. במבחנה, תאי CD4 + T helper נאיביים להסדיר את-Foxp3 ולהיות מחויבים לתכנית Treg על גירוי עם IL-2 וTGF-β 14,15. ייתכן שיש מתון לפלסטיות רבה בשושלות תאי CD4 + T, במיוחד כאשר בוחנים ייצור ציטוקינים רק (שנסקר ב17,18). עם זאת, למטרות פרוטוקולי בידול במבחנה, נדונונו בכל תת-קבוצה כשושלת ייחודית.
לאחרונה, קבוצת משנה של תאי TH17 שמייצר ציטוקינים IL-17 זוהתה כשושלת ייחודית עם פונקציות פרו-דלקתיות הבמיוחד פתוגניים בדלקת אוטואימונית 19-21. תאי TH17 להביע גורם שעתוק ייחודי, t גמא קולט היתום הקשורות retinoid מכונה (RORγt) המרכז את התכנית הגנטית TH17 22. TGFβ חשוב לדור של שושלת TH17 דרך האינדוקציה של RORγt. עם זאת, ההשפעה של איתות TGFβ הוא האמין כדי לגרום רק מחויבות TH17 על synergizing עם IL-6 (הנסקרת ב 12). מחקרים נוספים הראו כי מגוון רחב של אותות אחרים שיכולה באופן חיובי להסדיר את מחויבות TH17, כולל IL-1β, נתרן מוגבר, וTLR איתות 23-26. דיווחים אחרים לא הציעו כי תאי TH17 פתוגניים in vivo הם אלה שלמעשה לעקוף איתות TGFβ ובמקום להסתמך על שילוב של IL-1, IL-6, IL-23 והבידול שלהם 27. כך, תאי TH17 ניתן לגזור ממגוון רחב של מסלולי איתות; מסלול למטרות פרוטוקול זה, משמש בדרך כלל-(TGFβ וIL-6) למחויבות שושלת TH17יוצג.
פרוטוקולי הבידול מתוארים להלן לכל שושלות מפעיל מסתמך על נוגדנים קבועים כגירויים לTCR וCD28 במהלך הקורס כולו של הניסוי. עם זאת, אחרים הראו כי הפעלת TCR עם תאי מציגי אנטיגן 28 או אנטי-CD3 ונוגדנים נגד CD28 עם נוגדן אוגר cross-linking במשך 2 ימים 29 גם אמצעי היעיל ביותר לגרימת הדור של תת Th השונים. הפרוטוקול המובא כאן מתבסס על שיטות שדווחו בעבר לבידוד תאי CD4 + T עכבריים מאיברי הלימפה משניים 30 ויצירת תאי TH17 31. אחד הבדלים עיקריים הוא שפרוטוקול זה מסתמך על השימוש בסדרן תא לבודד תאי CD4 + T נאיביים מרקמות הלימפה. עם זאת, חברות רבות מציעות כעת ערכות הפרדה מהירות שיכול להעשיר לתאי CD4 + T הנאיבי, שייתכן שתוכל לעקוף את דרישת fאו מיון בהתאם לניסוי. השיטות וחומרים הכימיים שהוצגו בפרוטוקול זה מה שאנחנו משתמשים באופן שיגרתי ולמצוא להיות היעיל ביותר. עם זאת, יש לזכור כי חומרים כימיים ושיטות אלטרנטיביים קיימות עבור רבים מהצעדים שיוצגו להלן וזה תלוי למעבדה בודדת כדי לקבוע מה יעבוד הכי טוב למטרות שלהם.
Protocol
Representative Results
Discussion
בעוד הטחול מכיל תאי Th נאיביים, חלקם של אוכלוסייה זו בבלוטות לימפה הוא הרבה יותר גבוה. הכישלון לזהות כראוי ולהסיר בלוטות לימפה בפרוטוקול זה יגרום לתשואה ירודה של תאים נאיביים. זה יכול להיות קשה במיוחד בעכברים מבוגרים או עכברי זכרים שיש לי רקמת שומן יותר. כפי שניתן לראו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות לכל חברי המעבדה ריינולדס באוניברסיטת פרנקלין רוזלינד לרפואה ומדע, ומעבדת חן דונג באוניברסיטת טקסס מרכז סרטן MD Anderson לאופטימיזציה של פרוטוקול זה. עבודה זו נתמכה על ידי מענק לJMR מהמכונים הלאומי לבריאות (K22AI104941).
Materials
| Complete RPMI: | Warm in a 37 oC water bath before use | ||
| RPMI 1640 Media | Life Technologies | 11875119 | |
| 10 % FBS | Life Technologies | 26140-079 | |
| 1000X 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| 100X Pen/Strep | Life Technologies | 15140122 | |
| 100X L-glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| 120 micron nylon mesh | Amazon | CMN-0120-10YD | Cut into 2 cm2 squares and autoclave |
| Alternative: 100 micron cell strainers | Fisher | 08-771-19 | Alternative to cutting nylon mesh |
| autoMACS running buffer | Miltenyi | 130-091-221 | Warm in a 37 oC water bath before use |
| autoMACS rinsing solution | Miltenyi | 130-091-222 | Warm in a 37 oC water bath before use |
| CD4 beads | Miltenyi | 130-049-201 | |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| Cytokines: | |||
| Human (h) IL-2 | Peprotech | 200-02 | |
| Recombinant mouse (rm) IL-4 | Peprotech | 214-14 | |
| rmIL-6 | R & D Systems | 406-ML-025 | |
| rmIL-12 | Peprotech | 210-12 | |
| hTGFb | R & D Systems | 240-B-010 | |
| Antibodies: | |||
| 2C11 (anti-CD3) | BioXcell | BE0001-1 | |
| 37.51 (anti-CD28) | BioXcell | BE0015-1 | |
| 11B11 (anti-IL-4) | BioXcell | BE0045 | |
| XMG1.2 (anti-IFNg) | BioXcell | BE0055 | |
| anti-CD62L-FITC | BioLegend | 104406 | Use at 1:100 |
| anti-CD25-PE | BioLegend | 102008 | Use at 1:400 |
| anti-CD4-PerCP | BioLegend | 100434 | Use at 1:1000 |
| anti-CD44-APC | BioLegend | 103012 | Use at 1:500 |
| Phorbol 12-myristate 13 acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P-8139 | Prepare a stock at 0.1 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 oC |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I-0634 | Prepare a stock at 0.5 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 oC |
| Brefeldin A | eBioscience | 00-4506-51 | Use at 1:1000 |
References
- Mosmann, T. R., Cherwinski, H., Bond, M. W., Giedlin, M. A., Coffman, R. L. Two types of murine helper T cell clone. I. Definition according to profiles of lymphokine activities and secreted proteins. J Immunol. 136 (7), 2348-2357 (1986).
- Dong, C., Flavell, R. A. Cell fate decision: T-helper 1 and 2 subsets in immune responses. Arthritis Res. 2 (3), 179-188 (2000).
- Hsieh, C. S., et al. Development of TH1 CD4+ T cells through IL-12 produced by Listeria-induced macrophages. Science. 260 (5107), 547-549 (1993).
- Seder, R. A., Gazzinelli, R., Sher, A., Paul, W. E. Interleukin 12 acts directly on CD4+ T cells to enhance priming for interferon gamma production and diminishes interleukin 4 inhibition of such priming. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (21), 10188-10192 (1993).
- Szabo, S. J., et al. A novel transcription factor, T-bet, directs Th1 lineage commitment. Cell. 100 (6), 655-669 (2000).
- Afkarian, M., et al. T-bet is a STAT1-induced regulator of IL-12R expression in naive CD4. T cells. Nat Immunol. 3 (6), 549-557 (2002).
- Zhu, J., et al. The transcription factor T-bet is induced by multiple pathways and prevents an endogenous Th2 cell program during Th1 cell responses. Immunity. 37 (4), 660-673 (2012).
- Le Gros, G., Ben-Sasson, S. Z., Seder, R., Finkelman, F. D., Paul, W. E. Generation of interleukin 4 (IL-4)-producing cells in vivo and in vitro: IL-2 and IL-4 are required for in vitro generation of IL-4-producing cells. J Exp Med. 172 (3), 921-929 (1990).
- Swain, S. L., Weinberg, A. D., English, M., Huston, G. IL-4 directs the development of Th2-like helper effectors. J Immunol. 145 (11), 3796-3806 (1990).
- Zhang, D. H., Cohn, L., Ray, P., Bottomly, K., Ray, A. Transcription factor GATA-3 is differentially expressed in murine Th1 and Th2 cells and controls Th2-specific expression of the interleukin-5 gene. J Biol Chem. 272 (34), 21597-21603 (1997).
- Zheng, W., Flavell, R. A. The transcription factor GATA-3 is necessary and sufficient for Th2 cytokine gene expression in CD4 T cells. Cell. 89 (4), 587-596 (1997).
- Dong, C. TH17 cells in development: an updated view of their molecular identity and genetic programming. Nat Rev Immunol. 8 (5), 337-348 (2008).
- Jiang, S., Dong, C. A complex issue on CD4(+) T-cell subsets. Immunol Rev. 252 (1), 5-11 (2013).
- Rudensky, A. Y. Regulatory T cells and Foxp3. Immunol Rev. 241 (1), 260-268 (2011).
- Sakaguchi, S., Yamaguchi, T., Nomura, T., Ono, M. Regulatory T cells and immune tolerance. Cell. 133 (5), 775-787 (2008).
- Barzaghi, F., Passerini, L., Bacchetta, R. Immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, x-linked syndrome: a paradigm of immunodeficiency with autoimmunity. Front Immunol. 3, 211 (2012).
- Shea, J. J., Paul, W. E. Mechanisms underlying lineage commitment and plasticity of helper CD4 T cells. Science. 327 (5969), 1098-1102 (2010).
- Zhou, L., Chong, M. M., Littman, D. R. Plasticity of CD4+ T cell lineage differentiation. Immunity. 30 (5), 646-655 (2009).
- Harrington, L. E., et al. Interleukin 17-producing CD4+ effector T cells develop via a lineage distinct from the T helper type 1 and 2 lineages. Nat Immunol. 6 (11), 1123-1132 (2005).
- Langrish, C. L., et al. IL-23 drives a pathogenic T cell population that induces autoimmune inflammation. J Exp Med. 201 (2), 233-240 (2005).
- Park, H., et al. A distinct lineage of CD4 T cells regulates tissue inflammation by producing interleukin 17. Nat Immunol. 6 (11), 1133-1141 (2005).
- Ivanov, I. I., et al. The orphan nuclear receptor RORgammat directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells. Cell. 126 (6), 1121-1133 (2006).
- Chung, Y., et al. Critical regulation of early Th17 cell differentiation by interleukin-1 signaling. Immunity. 30 (4), 576-587 (2009).
- Reynolds, J. M., Martinez, G. J., Chung, Y., Dong, C. Toll-like receptor 4 signaling in T cells promotes autoimmune inflammation. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (32), 13064-13069 (2012).
- Reynolds, J. M., et al. Toll-like receptor 2 signaling in CD4(+) T lymphocytes promotes T helper 17 responses and regulates the pathogenesis of autoimmune disease. Immunity. 32 (5), 692-702 (2010).
- Wu, C., et al. Induction of pathogenic TH17 cells by inducible salt-sensing kinase SGK1. Nature. 496 (7446), 513-517 (2013).
- Ghoreschi, K., et al. Generation of pathogenic T(H)17 cells in the absence of TGF-beta signalling. Nature. 467 (7318), 967-971 (2010).
- Veldhoen, M., Hocking, R. J., Atkins, C. J., Locksley, R. M., Stockinger, B. TGFbeta in the context of an inflammatory cytokine milieu supports de novo differentiation of IL-17-producing T cells. Immunity. 24 (2), 179-189 (2006).
- Avni, O., et al. T(H) cell differentiation is accompanied by dynamic changes in histone acetylation of cytokine genes. Nat Immunol. 3 (7), 643-651 (2002).
- Matheu, M. P., Cahalan, M. D. Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification. J Vis Exp. (9), (2007).
- Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin, J. Isolation and th17 differentiation of naive CD4 T lymphocytes. J Vis Exp. (79), e50765 (2013).
