Выделение стволовых нервных / клеток-предшественников из Перивентрикулярные региона взрослых крыс и человека спинного мозга
Summary
The adult mammalian spinal cord contains neural stem/progenitor cells (NSPCs) that can be isolated and expanded in culture. This protocol describes the harvesting, isolation, culture, and passaging of NSPCs generated from the periventricular region of the adult spinal cord from the rat and from human organ transplant donors.
Abstract
Взрослой крысы и человека спинного мозга нервные клетки стволовые / предшественники (NSPCs), культивируемые в фактор роста обогащенного среды позволяет распространением мультипотентных, самообновлению, и расширяемые нервные стволовые клетки. В сыворотке крови условий, эти мультипотентные NSPCs будет отличать, генерировать нейроны, астроциты, олигодендроциты и. Собирают ткань ферментативно диссоциируют в растворе папаина-ЭДТА, а затем механически диссоциируют и отделены через градиент плотности прерывистой с образованием суспензии отдельных клеток, которые высевают в Neurobasal среде с добавлением фактора роста эпидермиса (EGF), основной фактор роста фибробластов (оФРФ ), и гепарин. Взрослых крыс спинного мозга NSPCs культивируют в свободном обращении нейросфер и взрослых спинного мозга человека NSPCs выращивают прикрепленных культур. В этих условиях, взрослые спинного мозга NSPCs пролиферируют, экспресс-маркеры клеток-предшественников, и может быть постоянно расширяется при прохождении. Эти клетки можно бе учился в пробирке в ответ на различные стимулы, и экзогенные факторы могут быть использованы для содействия ограничение клонов изучить нейронную дифференциацию стволовых клеток. МУЛЬТИПОТЕНТНЫХ NSPCs или их потомство также могут быть пересажены в различных животных моделях для оценки восстановительный ремонт.
Introduction
NSPCs мультипотентны клетки, совершенные в нервной линии, что может самостоятельно возобновить и расширить легко в пробирке. Мы называем эти клетки в виде смешанного населения нейронных стволовых клеток / клеток-предшественников, поскольку они отображают свойства самообновляющихся мультипотентными стволовых клеток и клеток-предшественников более ограниченных. NSPCs найдены как в плода и взрослого головного и спинного мозга 1,2. У взрослого, как правило, NSPCs покоя и находиться в пределах конкретных ниш в том числе субвентрикулярной зоны накладки боковых желудочков 2-4 и перивентрикулярном области, окружающей центральный канал спинного мозга 5,6.
Как правило, NSPCs культивируют в свободно плавающих нейросферах или в адгезивных монослоев в бессывороточной среде с добавлением EGF и оФРФ, митогены, которые отбирают для клеточных популяций стволовых / клеток-предшественников. Нейросфера анализ первоначально разработан Рейнольдса и Вайса 2, наиболее часто используется для культуры ирасширить нервные стволовые клетки. NSPCs показать мультипотентность, когда они высевают в фактор-Free роста среде, содержащей сыворотку, дифференцируя в нейроны, астроциты и олигодендроциты,. Мультипотентных, самообновлению NSPCs могут быть выделены и культивированы с взрослого грызуна спинного мозга при культивировании тканей включает области центрального канала 6,7. Потенциальное преимущество в использовании NSPCs, полученные от взрослого спинного мозга, в отличие от генерации клеток из других областей, что эти ткане-специфические клетки наиболее близко клеток в спинном мозге, которые утрачены или повреждены после травмы или болезни.
Предыдущая работа показала, что нейросферы полученные от взрослого человека спинного мозга не может распространяться долгосрочные или пассировать генерировать достаточное количество клеток 8,9. Тем не менее, с изменениями в условиях культивирования, мы сообщили о расширении и трансплантации взрослых спинного мозга NSPCs полученных человека, демонстрируя, что самообновлениюи мультипотентные NSPCs может быть изолирован от взрослого человека спинного мозга трансплантации органов доноров 10. В первую очередь, удаление большей части белого вещества при вскрытии и культивирование этих клеток на клейкого субстрата фактора роста в обогащенной среде выбраны для пролиферирующих взрослых спинного мозга NSPCs человека. В этом протоколе мы опишем сбор спинного мозга от взрослых крыс и человека от трансплантации органов доноров, рассечения перивентрикулярном ткани и выделения, культуры и расширение NSPCs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Во время вскрытия крыс спинного мозга помощи ткани должны быть приняты, чтобы не повредить спинной мозг при выполнении ламинэктомию. Это легче изолировать перивентрикулярные ткани, когда сегментов спинного мозга не повреждены. Сегменты ткани должны быть полностью погружены в рассече…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge support from Spinal Cord Injury Ontario, the Ontario-China Research and Innovation Fund, the Toronto General and Western Hospital Foundation, and Physicians’ Services Incorporated Foundation. The authors thank Dr. Tasneem Zahir for expert advice in human spinal cord NSPC culture, and Drs. Cindi Morshead and Iris Kulbatski for their expert advice in rat spinal cord NSPC isolation.
Materials
| 1X PBS | Life Technologies | #10010023 | Dissection buffer |
| 1X HBSS | Life Technologies | #14175095 | Dissection buffer |
| D-glucose | Sigma | # G-6152 | Prepare 30% glucose stock solution for dissection buffer and hormone mix |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | #15140-148 | Dissection buffer and culture medium |
| Neurobasal-A | Life Technologies | #10888-022 | Culture medium |
| L-glutamine, 200mM | Life Technologies | #25030-081 | Culture medium |
| B27 | Life Technologies | #12587010 | Culture medium |
| DMEM | Life Technologies | #11885084 | Hormone mix |
| F12 | Life Technologies | #21700-075 | Hormone mix |
| NaHCO3 | Sigma | # S-5761 | Prepare 7.5% NaHCO3 stock solution for hormone mix |
| HEPES | Sigma | #H9136 | Prepare 1M HEPES stock solution for hormone mix |
| Insulin | Sigma | #I-5500 | Hormone mix |
| Apo-transferrin | Sigma | #T-2252 | Hormone mix |
| Putrescine | Sigma | # P7505 | Hormone mix |
| Selenium | Sigma | #S-9133 | Hormone mix |
| Progesterone | Sigma | #P-6149 | Hormone mix |
| EGF, mouse | Sigma | #E4127 | Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium |
| EGF, human recombinant | Sigma | #E9644 | Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium |
| bFGF, human recombinant | Sigma | #F0291 | Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium |
| Heparin, 10000U | Sigma | #H3149 | Prepare 27.3 mg/ml stocks in hormone mix and aliquot; EFH medium |
| Papain dissociation kit | Worthington Biochemicals | #LK003150 | Contains EBSS, papain, DNase, ovomucoid protease inhibitor with BSA |
| Sodium Pentobarbital | Bimeda – MTC Animal Health Inc | DIN 00141704 | |
| Tissue Forceps: Addisons | Fine Science Tools | #11006-12 | Serrated standard tip; micro-tip also available |
| Fine Forceps: Dumont #4 | Fine Science Tools | #11241-30 | |
| Microscissors | Fine Science Tools | #15024-10 | Round-handled Vannas |
| Rongeurs | Bausch & Lomb | N1430 | |
| 10mm Petri dishes | Nunc | 1501 | |
| T25 Culture flasks | Nunc | 156367 | |
| 40 μm nylon cell strainer | VWR | CA21008-949 | |
| 6 well plates | Nunc | CA73520-906 | |
| Matrigel, growth factor reduced (100X) | Corning | 354230 | Thaw according to directions and freeze aliquots; use diluted at a ratio of 40 μl Matrigel: 1 ml SFM |
References
- Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287, 1433-1438 (2000).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Gritti, A., et al. Multipotential stem cells from the adult mouse brain proliferate and self-renew in response to basic fibroblast growth factor. J Neurosci. 16, 1091-1100 (1996).
- Morshead, C. M., et al. Neural stem cells in the adult mammalian forebrain: a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells. Neuron. 13, 1071-1082 (1994).
- Weiss, S., et al. Multipotent CNS stem cells are present in the adult mammalian spinal cord and ventricular neuroaxis. J Neurosci. 16, 7599-7609 (1996).
- Martens, D. J., Seaberg, R. M., van der Kooy, D. In vivo infusions of exogenous growth factors into the fourth ventricle of the adult mouse brain increase the proliferation of neural progenitors around the fourth ventricle and the central canal of the spinal cord. Eur J Neurosci. 16, 1045-1057 (2002).
- Kulbatski, I., et al. Oligodendrocytes and radial glia derived from adult rat spinal cord progenitors: morphological and immunocytochemical characterization. J Histochem Cytochem. 55, 209-222 (2007).
- Akesson, E., et al. Long-term culture and neuronal survival after intraspinal transplantation of human spinal cord-derived neurospheres. Physiol Behav. 92, 60-66 (2007).
- Dromard, C., et al. Adult human spinal cord harbors neural precursor cells that generate neurons and glial cells in vitro. J Neurosci Res. 86, 1916-1926 (2008).
- Mothe, A. J., Zahir, T., Santaguida, C., Cook, D., Tator, C. H. Neural stem/progenitor cells from the adult human spinal cord are multipotent and self-renewing and differentiate after transplantation. PLoS One. 6, e27079 (2011).
- Huettner, J. E., Baughman, R. W. Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats. J Neurosci. 6, 3044-3060 (1986).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. J Vis Exp. , (2010).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres–re-evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
- Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nat Methods. 3, 801-806 (2006).
- Louis, S. A., Azari, H., Sharififar, S., Vedam-Mai, V., Reynolds, B. A. Neural-colony forming cell assay: an assay to discriminate bona fide neural stem cells from neural progenitor cells. J Vis Exp. , (2011).
- Louis, S. A., et al. Enumeration of neural stem and progenitor cells in the neural colony-forming cell assay. Stem Cells. 26, 988-996 (2008).
- Conti, L., et al. Niche-independent symmetrical self-renewal of a mammalian tissue stem cell. PLoS Biol. 3, e10 (2005).
- Pollard, S. M., Conti, L., Sun, Y., Goffredo, D., Smith, A. Adherent neural stem (NS) cells from fetal and adult forebrain. Cereb Cortex. 16, i112-i120 (2006).
