Isolamento di Neural cellule staminali / progenitrici dalla Regione periventricolare del ratto adulto e midollo spinale umano
Summary
The adult mammalian spinal cord contains neural stem/progenitor cells (NSPCs) that can be isolated and expanded in culture. This protocol describes the harvesting, isolation, culture, and passaging of NSPCs generated from the periventricular region of the adult spinal cord from the rat and from human organ transplant donors.
Abstract
Ratto adulto e del midollo spinale cellule neurali staminali / progenitrici umane (NSPCs) coltivate in crescita a medio fattore arricchito consente la proliferazione di multipotenti, e le cellule staminali neurali espandibili auto-rinnovamento. In condizioni di siero, questi NSPCs multipotenti si differenziano, generando neuroni, astrociti, oligodendrociti e. Il tessuto raccolto viene enzimaticamente dissociato in una soluzione di papaina-EDTA e poi dissociato meccanicamente e separati mediante un gradiente di densità discontinuo per produrre una sospensione di cellule singole che è placcato in medium Neurobasal supplementato con fattore di crescita epidermico (EGF), fattore di crescita basico dei fibroblasti (bFGF ), ed eparina. Ratto adulto NSPCs midollo spinale sono coltivate come neurosfere libero di fluttuare e adulti NSPCs midollo spinale umano vengono coltivate come le culture aderenti. In queste condizioni, per adulti NSPCs midollo spinale proliferano, i marcatori espressi di cellule precursori, e possono essere continuamente ampliati al passaggio. Queste cellule possono be studiato in vitro in risposta a vari stimoli, e fattori esogeni può essere usato per promuovere restrizione lineage esaminare neurali differenziazione delle cellule staminali. Multipotenti NSPCs o loro discendenti possono essere trapiantate in vari modelli animali per valutare riparazione rigenerativa.
Introduction
NSPCs sono cellule multipotenti impegnate per il lignaggio neurale che possono auto rinnovarsi e facilmente espandere in vitro. Ci riferiamo a queste cellule come una popolazione mista di cellule staminali / progenitrici neurali dal momento che espongono proprietà delle cellule staminali multipotenti auto-rinnovamento e progenitori più ristretti. NSPCs si trovano sia nel cervello fetale e adulto e il midollo spinale 1,2. Nell'adulto, NSPCs sono normalmente quiescenti e di soggiornare all'interno di nicchie specifiche, tra cui la zona subventricolare rivestimento dei ventricoli laterali 2-4, e la regione periventricolare che circonda il canale centrale del 5,6 del midollo spinale.
In genere, NSPCs sono coltivate come neurosfere fluttuanti o monostrato come aderenti in mezzo privo di siero integrato con EGF e bFGF, mitogeni che selezionano per le popolazioni di cellule staminali / progenitrici. Il saggio neurosfere originariamente sviluppato da Reynolds e Weiss 2, è più comunemente usato per la cultura eespandere le cellule staminali neurali. NSPCs mostrano multipotenza quando sono placcati in siero terreno contenente senza fattore di crescita, differenziarsi in neuroni, astrociti, oligodendrociti e. Multipotenti, NSPCs auto-rinnovamento possono essere isolate e coltivate da roditore midollo spinale adulto quando il tessuto coltivato comprende le regioni del canale centrale 6,7. Un potenziale vantaggio nell'utilizzo NSPCs generati dal midollo spinale adulto al contrario di generare cellule da altre regioni è che queste cellule tessuto-specifiche più simili cellule del midollo spinale che sono perso o danneggiato seguenti infortunio o malattia.
Lavoro precedente ha mostrato che neurosfere derivate dal midollo spinale adulto umano non vengano estese a lungo termine o diversi passaggi per generare un numero sufficiente di cellule 8,9. Tuttavia, con modificazioni in condizioni di coltura, abbiamo riportato l'espansione e trapianto di midollo NSPCs derivati da spinale umani adulti, dimostrando che l'auto-rinnovamentoe NSPCs multipotenti possono essere isolate dal midollo spinale adulto umano dei donatori di trapianto di organi 10. Principalmente, la rimozione della maggior parte della sostanza bianca durante la dissezione e coltura di tali cellule su un substrato aderente in crescita a medio fattore arricchito selezionato per proliferanti adulti NSPCs midollo spinale umano. In questo protocollo si descrive la raccolta del midollo spinale di ratto adulto e da donatori umani di trapianto di organi, la dissezione dei tessuti periventricolare, e l'isolamento, la cultura e l'espansione di NSPCs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Durante la dissezione del midollo spinale di ratto cura tessuto dovrebbe essere presa non danneggiare il midollo spinale durante l'esecuzione della laminectomia. È facile isolare il tessuto periventricular quando i segmenti del midollo spinale sono intatti. I segmenti di tessuto devono essere completamente immersi in tampone dissezione e le meningi sovrastanti e della sostanza bianca possono essere tagliate via come strisce longitudinali con microscissors. In alternativa, pinze dei tessuti fini possono essere utili…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge support from Spinal Cord Injury Ontario, the Ontario-China Research and Innovation Fund, the Toronto General and Western Hospital Foundation, and Physicians’ Services Incorporated Foundation. The authors thank Dr. Tasneem Zahir for expert advice in human spinal cord NSPC culture, and Drs. Cindi Morshead and Iris Kulbatski for their expert advice in rat spinal cord NSPC isolation.
Materials
| 1X PBS | Life Technologies | #10010023 | Dissection buffer |
| 1X HBSS | Life Technologies | #14175095 | Dissection buffer |
| D-glucose | Sigma | # G-6152 | Prepare 30% glucose stock solution for dissection buffer and hormone mix |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | #15140-148 | Dissection buffer and culture medium |
| Neurobasal-A | Life Technologies | #10888-022 | Culture medium |
| L-glutamine, 200mM | Life Technologies | #25030-081 | Culture medium |
| B27 | Life Technologies | #12587010 | Culture medium |
| DMEM | Life Technologies | #11885084 | Hormone mix |
| F12 | Life Technologies | #21700-075 | Hormone mix |
| NaHCO3 | Sigma | # S-5761 | Prepare 7.5% NaHCO3 stock solution for hormone mix |
| HEPES | Sigma | #H9136 | Prepare 1M HEPES stock solution for hormone mix |
| Insulin | Sigma | #I-5500 | Hormone mix |
| Apo-transferrin | Sigma | #T-2252 | Hormone mix |
| Putrescine | Sigma | # P7505 | Hormone mix |
| Selenium | Sigma | #S-9133 | Hormone mix |
| Progesterone | Sigma | #P-6149 | Hormone mix |
| EGF, mouse | Sigma | #E4127 | Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium |
| EGF, human recombinant | Sigma | #E9644 | Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium |
| bFGF, human recombinant | Sigma | #F0291 | Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium |
| Heparin, 10000U | Sigma | #H3149 | Prepare 27.3 mg/ml stocks in hormone mix and aliquot; EFH medium |
| Papain dissociation kit | Worthington Biochemicals | #LK003150 | Contains EBSS, papain, DNase, ovomucoid protease inhibitor with BSA |
| Sodium Pentobarbital | Bimeda – MTC Animal Health Inc | DIN 00141704 | |
| Tissue Forceps: Addisons | Fine Science Tools | #11006-12 | Serrated standard tip; micro-tip also available |
| Fine Forceps: Dumont #4 | Fine Science Tools | #11241-30 | |
| Microscissors | Fine Science Tools | #15024-10 | Round-handled Vannas |
| Rongeurs | Bausch & Lomb | N1430 | |
| 10mm Petri dishes | Nunc | 1501 | |
| T25 Culture flasks | Nunc | 156367 | |
| 40 μm nylon cell strainer | VWR | CA21008-949 | |
| 6 well plates | Nunc | CA73520-906 | |
| Matrigel, growth factor reduced (100X) | Corning | 354230 | Thaw according to directions and freeze aliquots; use diluted at a ratio of 40 μl Matrigel: 1 ml SFM |
References
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