Isolatie van neurale stamcellen / stamcellen uit de periventriculaire regio van de volwassen rat en Human Spinal Cord
Summary
The adult mammalian spinal cord contains neural stem/progenitor cells (NSPCs) that can be isolated and expanded in culture. This protocol describes the harvesting, isolation, culture, and passaging of NSPCs generated from the periventricular region of the adult spinal cord from the rat and from human organ transplant donors.
Abstract
Volwassen ratten en menselijk ruggenmerg neurale stam / progenitorcellen (NSPCs) gekweekt in growth factor-verrijkt medium maakt de proliferatie van multipotente, zelfvernieuwende en expandeerbare neurale stamcellen. In serum condities, zullen deze multipotente NSPCs differentiëren genereren neuronen, astrocyten en oligodendrocyten. Het geoogste weefsel enzymatisch gedissocieerd in een papaïne-EDTA-oplossing en vervolgens mechanisch gedissocieerd en gescheiden door een discontinue dichtheidsgradiënt met een enkele celsuspensie wordt uitgeplaat die in Neurobasal medium aangevuld met epidermale groeifactor (EGF), basic fibroblast growth factor waardoor (bFGF ) en heparine. Volwassen rat ruggenmerg NSPCs worden gekweekt als vrij zwevende neurospheres en menselijke ruggenmerg NSPCs volwassen worden gekweekt als adherente culturen. Onder deze omstandigheden, volwassen ruggenmerg NSPCs vermenigvuldigen, express markers van voorloper cellen, en kan continu worden uitgebreid op passage. Deze cellen kunnen be bestudeerd in vitro in reactie op verschillende stimuli, en exogene factoren worden gebruikt om lineage restrictie bevorderen neurale stamcel differentiatie te onderzoeken. Multipotente NSPCs of hun nageslacht kan ook worden getransplanteerd in verschillende diermodellen om regeneratief herstel te beoordelen.
Introduction
NSPCs zijn multipotent cellen toegewijd aan de neurale lijn die kan zichzelf vernieuwen en gemakkelijk uit te breiden in vitro. We verwijzen naar deze cellen als een gemengde populatie van neurale stamcellen / voorlopercellen, omdat ze geven eigenschappen van zelf-vernieuwing van multipotente stamcellen en meer beperkt voorouders. NSPCs worden gevonden in zowel de foetale en volwassen hersenen en het ruggenmerg 1,2. In de volwassen, NSPCs zijn doorgaans rustige en te verblijven binnen specifieke niches waaronder de subventriculaire zone langs de laterale ventrikels 2-4, en de periventriculaire regio rond het centrale kanaal van het ruggenmerg 5,6.
Gewoonlijk NSPCs gekweekt als vrij zwevende neurosferen of als hechtende monolagen in serumvrij medium aangevuld met EGF en bFGF, mitogenen die selecteren op de stam / voorlopercellen celpopulaties. De neurosphere assay oorspronkelijk ontwikkeld door Reynolds en Weiss 2, wordt het meest gebruikt om de cultuur en deuitbreiding van neurale stamcellen. NSPCs tonen multipotent wanneer ze uitgeplaat in growth factor-vrij medium dat serum, differentiëren tot neuronen, astrocyten en oligodendrocyten. Multipotente, kan zelfvernieuwende NSPCs worden geïsoleerd en gekweekt uit het volwassen knaagdieren ruggenmerg wanneer de gekweekte weefsel omvat regio's van het centrale kanaal 6,7. Een potentieel voordeel bij het gebruik NSPCs gegenereerd uit het ruggenmerg volwassen tegenover genererende cellen uit andere gebieden is dat deze weefselspecifieke cellen meest op lijken cellen in het ruggenmerg die verloren gaan of beschadigd door verwonding of ziekte.
Eerder werk toonde aan dat neurosferen van het menselijk ruggemerg volwassen niet kon worden gepropageerd langdurige of gepasseerd om voldoende aantallen cellen te genereren 8,9. Echter, met wijzigingen in kweekomstandigheden, we meldde de uitbreiding en transplantatie van volwassen menselijke ruggenmerg afgeleid NSPCs, waaruit blijkt dat de zelf-vernieuwingen multipotent NSPCs kunnen worden geïsoleerd uit de menselijke ruggenmerg van orgaantransplantatie donors 10 volwassene. Vooral het verwijderen van de meeste witte stof tijdens dissectie en kweken van deze cellen op een hechtende substraat growth factor-verrijkt medium geselecteerd vanwege prolifererende menselijke spinal cord NSPCs volwassene. In dit protocol beschrijven we het oogsten van het ruggenmerg van volwassen rat en van mens orgaantransplantatie donors, dissectie van de periventriculaire weefsel, en het isoleren, kweken en uitbreiden van NSPCs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tijdens de dissectie van de rat ruggenmergweefsel zorg moet worden genomen het ruggenmerg niet te beschadigen tijdens het uitvoeren van de laminectomie. Het is gemakkelijker om de periventriculaire weefsel te isoleren wanneer de ruggenmergsegmenten intact. Het weefsel segmenten moet volledig worden ondergedompeld in de dissectie buffer en de bovenliggende hersenvliezen en witte stof kan worden weggesneden als longitudinale stroken met microscissors. Als alternatief kan fijn weefsel tang worden gebruikt om de witte stof …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge support from Spinal Cord Injury Ontario, the Ontario-China Research and Innovation Fund, the Toronto General and Western Hospital Foundation, and Physicians’ Services Incorporated Foundation. The authors thank Dr. Tasneem Zahir for expert advice in human spinal cord NSPC culture, and Drs. Cindi Morshead and Iris Kulbatski for their expert advice in rat spinal cord NSPC isolation.
Materials
| 1X PBS | Life Technologies | #10010023 | Dissection buffer |
| 1X HBSS | Life Technologies | #14175095 | Dissection buffer |
| D-glucose | Sigma | # G-6152 | Prepare 30% glucose stock solution for dissection buffer and hormone mix |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | #15140-148 | Dissection buffer and culture medium |
| Neurobasal-A | Life Technologies | #10888-022 | Culture medium |
| L-glutamine, 200mM | Life Technologies | #25030-081 | Culture medium |
| B27 | Life Technologies | #12587010 | Culture medium |
| DMEM | Life Technologies | #11885084 | Hormone mix |
| F12 | Life Technologies | #21700-075 | Hormone mix |
| NaHCO3 | Sigma | # S-5761 | Prepare 7.5% NaHCO3 stock solution for hormone mix |
| HEPES | Sigma | #H9136 | Prepare 1M HEPES stock solution for hormone mix |
| Insulin | Sigma | #I-5500 | Hormone mix |
| Apo-transferrin | Sigma | #T-2252 | Hormone mix |
| Putrescine | Sigma | # P7505 | Hormone mix |
| Selenium | Sigma | #S-9133 | Hormone mix |
| Progesterone | Sigma | #P-6149 | Hormone mix |
| EGF, mouse | Sigma | #E4127 | Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium |
| EGF, human recombinant | Sigma | #E9644 | Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium |
| bFGF, human recombinant | Sigma | #F0291 | Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium |
| Heparin, 10000U | Sigma | #H3149 | Prepare 27.3 mg/ml stocks in hormone mix and aliquot; EFH medium |
| Papain dissociation kit | Worthington Biochemicals | #LK003150 | Contains EBSS, papain, DNase, ovomucoid protease inhibitor with BSA |
| Sodium Pentobarbital | Bimeda – MTC Animal Health Inc | DIN 00141704 | |
| Tissue Forceps: Addisons | Fine Science Tools | #11006-12 | Serrated standard tip; micro-tip also available |
| Fine Forceps: Dumont #4 | Fine Science Tools | #11241-30 | |
| Microscissors | Fine Science Tools | #15024-10 | Round-handled Vannas |
| Rongeurs | Bausch & Lomb | N1430 | |
| 10mm Petri dishes | Nunc | 1501 | |
| T25 Culture flasks | Nunc | 156367 | |
| 40 μm nylon cell strainer | VWR | CA21008-949 | |
| 6 well plates | Nunc | CA73520-906 | |
| Matrigel, growth factor reduced (100X) | Corning | 354230 | Thaw according to directions and freeze aliquots; use diluted at a ratio of 40 μl Matrigel: 1 ml SFM |
References
- Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287, 1433-1438 (2000).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Gritti, A., et al. Multipotential stem cells from the adult mouse brain proliferate and self-renew in response to basic fibroblast growth factor. J Neurosci. 16, 1091-1100 (1996).
- Morshead, C. M., et al. Neural stem cells in the adult mammalian forebrain: a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells. Neuron. 13, 1071-1082 (1994).
- Weiss, S., et al. Multipotent CNS stem cells are present in the adult mammalian spinal cord and ventricular neuroaxis. J Neurosci. 16, 7599-7609 (1996).
- Martens, D. J., Seaberg, R. M., van der Kooy, D. In vivo infusions of exogenous growth factors into the fourth ventricle of the adult mouse brain increase the proliferation of neural progenitors around the fourth ventricle and the central canal of the spinal cord. Eur J Neurosci. 16, 1045-1057 (2002).
- Kulbatski, I., et al. Oligodendrocytes and radial glia derived from adult rat spinal cord progenitors: morphological and immunocytochemical characterization. J Histochem Cytochem. 55, 209-222 (2007).
- Akesson, E., et al. Long-term culture and neuronal survival after intraspinal transplantation of human spinal cord-derived neurospheres. Physiol Behav. 92, 60-66 (2007).
- Dromard, C., et al. Adult human spinal cord harbors neural precursor cells that generate neurons and glial cells in vitro. J Neurosci Res. 86, 1916-1926 (2008).
- Mothe, A. J., Zahir, T., Santaguida, C., Cook, D., Tator, C. H. Neural stem/progenitor cells from the adult human spinal cord are multipotent and self-renewing and differentiate after transplantation. PLoS One. 6, e27079 (2011).
- Huettner, J. E., Baughman, R. W. Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats. J Neurosci. 6, 3044-3060 (1986).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. J Vis Exp. , (2010).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres–re-evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
- Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nat Methods. 3, 801-806 (2006).
- Louis, S. A., Azari, H., Sharififar, S., Vedam-Mai, V., Reynolds, B. A. Neural-colony forming cell assay: an assay to discriminate bona fide neural stem cells from neural progenitor cells. J Vis Exp. , (2011).
- Louis, S. A., et al. Enumeration of neural stem and progenitor cells in the neural colony-forming cell assay. Stem Cells. 26, 988-996 (2008).
- Conti, L., et al. Niche-independent symmetrical self-renewal of a mammalian tissue stem cell. PLoS Biol. 3, e10 (2005).
- Pollard, S. M., Conti, L., Sun, Y., Goffredo, D., Smith, A. Adherent neural stem (NS) cells from fetal and adult forebrain. Cereb Cortex. 16, i112-i120 (2006).
