العدوى البكتيرية النظامية والمناعة الظواهر الدفاع في<em> الدروسوفيلاميلانوجاستر</em
Summary
Drosophila melanogaster is an outstanding model organism for studying innate immune systems and the physiological consequences of infection and disease. This protocol describes how to deliver robust and quantitatively repeatable bacterial infections to D. melanogaster, and how to subsequently measure infection severity and quantify the host immune response.
Abstract
ذبابة الفاكهة ذبابة الفاكهة السوداء البطن هو واحد من الكائنات النموذجية رئيس الوزراء لدراسة وظيفة وتطور الدفاع المناعي. هي الحفاظ العديد من الحصانة الفطرية الجوانب بين الحشرات والثدييات، ومنذ ذبابة الفاكهة يمكن بسهولة وراثيا وتجريبيا التلاعب بها، فهي قوية لدراسة وظيفة الجهاز المناعي والآثار الفسيولوجية للمرض. الإجراء أثبت هنا يسمح إصابة الذباب بواسطة إدخال البكتيريا مباشرة في تجويف الجسم، وتجاوز الحواجز الظهارية وأشكال أكثر سلبية للدفاع والسماح التركيز على العدوى النظامية. ويشمل الإجراء بروتوكولات لمعدلات قياس وفيات المضيف، تحميل الممرض النظامية، ودرجة تحريض الجهاز المناعي المضيف. هذا الإجراء العدوى غير مكلفة وقوية وقابلة للتكرار كميا، ويمكن استخدامها في دراسات علم الوراثة وظيفية، التطوري تاريخ الحياة، وعلم وظائف الأعضاء.
Introduction
ذبابة الفاكهة ذبابة الفاكهة السوداء البطن هو واحد من الكائنات النموذجية رئيس الوزراء لدراسة وظيفة وتطور الدفاع المناعي. ذبابة الفاكهة هي غير مكلفة وسهلة العمق، هي قابلة للغاية للتلاعب التجريبية، والمدعومة من قبل المجتمع العلمي واسعة النطاق التي وضعت عريضة مجموعة من أدوات البحث. يتم حفظها العديد من الحصانة الفطرية الجوانب بين الحشرات والثدييات، بما في ذلك نقل الإشارة بوساطة مستقبلات تول مثل وNF كيلوبايت عوامل النسخ الأسرة، JAK / STAT الإشارات، وردود مسار JNK 1،2 وظيفة هذه الجينات ومسارات يمكن يمكن الاستعلام في D. البطن باستخدام الطفرات أو رني knockdowns أن زيادة أو نقصان مسار الأنشطة 3 – 6 بالإضافة إلى ذلك، ذبابة الفاكهة يمكن استخدامها لدراسة الآثار الفسيولوجية للعدوى والمرض، بما في ذلك في سياق التطور نظرية التاريخ الحياة 7.– 9 جميع هذه الدراسات، ومع ذلك، تعتمد على القدرة على إصابة موثوق الذباب التجريبية في ظل ظروف العلاج المحددة. الإجراء الموضح هنا يمثل الإطار المنهجي لتقديم الالتهابات البكتيرية قوية ومتكررة لذبابة الفاكهة السوداء البطن وبعد ذلك قياس شدة الإصابة وقياس الاستجابة المناعية.
ذبابة الفاكهة يمكن بطبيعة الحال وتجريبيا بالعدوى عن طريق مجموعة واسعة من الطفيليات ومسببات الأمراض، بما في ذلك البكتيريا والفطريات والفيروسات والديدان والطفيليات الدبابير. ويركز البروتوكول الحالي على تقديم عدوى بكتيرية النظامية. العديد من أنواع البكتيريا المختلفة التي يمكن استخدامها لتصيب الذباب، وينبغي أن يستند اختيار مجرب على الأسئلة العلمية الدقيقة التي طلب منها ذلك. على سبيل المثال، يمكن استخدامها العزلات السريرية البشرية لدراسة آليات الفوعة البكتيرية 10، أو بيئيا العزلات ذات الصلة قد تكون preferreد لدراسة تطورية. 11 بعض أنواع البكتيريا الممرضة المختصة D. البطن، تنتشر على العدوى والتسبب في المرض المضيف أو الموت. وتمكنت البكتيريا الأخرى على نحو فعال من قبل النظام المناعي المضيفة وبرأت في غضون أيام قليلة. في هذه المظاهرة، سيتم استخدام بروفيدنسيا الرتغرية كما الممرض التكاثري التي يمكن أن تسبب وفيات المضيفة واستمرت في المضيفين على قيد الحياة. وسوف تستخدم الإشريكية القولونية كغير الممرض التي يتم تطهيرها من قبل النظام المناعي المضيف.
وسيتم إنشاء العدوى عن طريق إدخال البكتيريا مباشرة في تجويف الجسم من الطاير. هذا النهج يتجاوز الحواجز الظهارية والسلوكيات الوقائية، مما يتيح التحقيق في العدوى النظامية بصرف النظر عن طريقة طبيعية لانتقال العدوى. هناك طريقتان الأساسية لإنشاء تجريبيا العدوى النظامية. في المرحلة الأولى، يتم استخدام nanoinjector وسحب الزجاج الشعرية الإبر لحقن العدد الدقيق للالبكتيريا في الطيران. هذا الأسلوب له مزايا السماح لمجموعة ديناميكية كبيرة من جرعات العدوى وكونها من الناحية الكمية تكرار للغاية. النهج الثاني هو تقديم الإصابة بوخز الصرف الصحي. هذا النهج لديه مزايا يجري السريع والتي لا تتطلب أية معدات خاصة. مرة واحدة يتم وضع العدوى، يصبح من الممكن قياس حمولة النظامية الممرض، وفيات المضيف، ومحرض نشاط الجهاز المناعي. بالطبع، يمكن تصور أن يقاس أي عدد من الظواهر إضافية في D. المصاب البطن، بما في ذلك بعد الإصابة الخصوبة 12، القدرة على التعلم 13، والوضع الأيضي 14، أو تقريبا أي سمة أخرى يمكن أن يتصور.
Protocol
Representative Results
Discussion
الإجراء الموضح هنا غلة العدوى الجودة الصارمة وارتفاع ذبابة الفاكهة السوداء البطن. الأمثلة يتضح تركز في المقام الأول على الإصابة بروفيدنسيا الرتغرية وE. القولونية، ولكن البروتوكول هو متكيف جدا ويمكن تطبيقها على العدوى بالبكتيريا المتنوعة على مجموعة من الشروط تربية المضيفة والصيانة.
وتفاصيل هذا النهج التجريبي الأمثل تعتمد على البكتيريا المستخدمة للعدوى، وراثى للمضيف، والظروف التجريبية الشاملة. فمن المستحسن لاختبار تجريبي أي ظروف تجريبية جديدة قبل الشروع في مشاريع أكثر طموحا. وهناك نقطة انطلاق جيدة لاختبار ثلاث جرعات العدوى على نطاق 100 أضعاف. للغاية في كثير من الأحيان أفضل عرض مسببات الأمراض الفتاكة المعدية عند تناول جرعات منخفضة جدا، بناء على أمر من 10-100 الخلايا البكتيرية في الطيران. ويمكن حقن مسببات الأمراض الأكثر اعتدالا في جرعات أعلى من حوالي 1،000 البكتيريا في فلوريداص، وغير الممرضة قد يتم حقنه بجرعات عالية مثل 10000 بكتيريا في كل الطاير. غالبا ما يكون من المفيد أن تعرف حركية العدوى الجديدة من خلال تتبع حمولة الممرض، وفيات المضيف، ونشاط الجهاز المناعي على سلسلة زمنية طولية. لأن قياس الحمولة الممرض والتعبير الجيني المضيف والمقايسات مدمرة، فمن الضروري أن تصيب الذباب متميزة في بداية التجربة في كل نقطة زمنية وهذا هو المراد قياسها.
عند اتخاذ قرار ما إذا كان استخدام الوخز بالابر أو حقن القائم على microcapillary، فمن المهم أن نلاحظ أن هناك مزايا وعيوب كل نهج. حقن الشعرية يدخل حجم السائل في الطيران، وكلاهما يزيد متواضعة ضغط الامتلاء ويدخل الأملاح أو الجزيئات الأخرى التي يتم تعليق أو الذائبة في الناقل. يتطلب حقن الشعرية أيضا الوصول إلى مرفق حقن أو شراء المعدات اللازمة. ما تستهلكه الصرف الصحي لا يتطلب أي معدات خاصة ويدخلوسائل الاعلام لا تذكر في الطيران، وعادة ما يكون أكثر كفاءة لإصابة أعداد كبيرة من الذباب. ومع ذلك، والتهابات الوخز بالابر لا تسمح مراقبة دقيقة على جرعة العدوى التي يمكن أن يتحقق مع حقن الشعرية. ركز هذا البروتوكول على جهاز حقن أن ينظم ميكانيكيا حجم الحقن، ولكن هناك أيضا أنظمة حقن استنادا نبضات منفصلة من الهواء المضغوط. 20،21 هذه هي عادة أغلى من الأجهزة واردة هنا وتتطلب معايرة نبض الهواء على كل إبرة من أجل ضمان حقن كميات ثابتة.
هناك جدلا كبيرا ولكن البيانات قليلة جدا عن كيف تصبح الذباب المصابة بشكل منتظم مع البكتيريا في البرية. بعض المحققين يفترضون أن غالبية الإصابات الطبيعية تحدث عندما ذبابة الفاكهة ابتلاع الجراثيم المسببة للأمراض والبكتيريا وبعد ذلك تمكن من الفرار القناة الهضمية لإقامة العدوى النظامية. ومع ذلك، هناك جدا الحديدالبكتيريا ث المعروفة لتكون قادرة على عبور القناة الهضمية من D. البطن، وتلك التي لديها هذه القدرة هي قاتلة للغاية لالذباب 22،23. نظرية بديلة هي التي تطير بانتظام إصابات جليدية من خلال الهروب من محاولات الافتراس فشل أو هجوم من قبل العث ectoparasitic. ويدعم هذه الفرضية من قبل مجموعة متكررة من البرية D. البطن تحمل بقع التصبغ التي تدل على الجروح تلتئم (الملاحظات غير منشورة). وقد ثبت العث لنقل العدوى البكتيرية في ذبابة الفاكهة 24 والجراح التي العث اليسار يمكن أن يصاب بشكل ثانوي عن طريق البكتيريا في عسل النحل 25. ومع ذلك، فإن تردد في طبيعة الإصابة سوس مدفوعة أو غير ذلك من الانتهازية D. البطن من خلال الخروقات بشرة غير معروف. بروتوكول الموصوفة هنا يسمح إدخال البكتيريا مباشرة في الدملمف من خلال حقن الكمي الذي يتجاوز أي حواجز الظهارية أو immu السلوكيةnity. طرق لتغذية البكتيريا الممرضة للD. وقد وصفت البطن في Vodovar وآخرون. 22 ونعمة وآخرون. 23.
العديد من أنواع البكتيريا الممرضة للحشرات تشكل مخاطر قليلة أو معدومة على صحة الإنسان، مما يسمح للباحثين للعمل معهم بشكل مريح. وعلاوة على ذلك، عدد قليل جدا من البكتيريا لديها القدرة على إصابة ذبابة الفاكهة على اتصال دون تدخل التجريبية، وبالتالي فإن خطر "وباء" انتشار العدوى البكتيرية من خلال المختبر عبر الأسطح الملوثة أو هرب الذباب بشكل عام منخفضة جدا. ومع ذلك، فإنه من المستحسن للتأكد من أن تدابير احتواء الكافية في المكان لمنع الذباب المصابة من الهرب ويسترد أي الذباب لاذوا بالفرار. يجب تجهيزه المختبر على مستوى السلامة البيولوجية يتناسب مع أن من مسببات الأمراض المستخدمة، وينبغي استخدام أفضل الممارسات القياسية في علم الأحياء الدقيقة.
وinfecti تجريبيعلى الطريقة الموصوفة هنا يسمح للأمراض المعدية من ذبابة الفاكهة السوداء البطن مع أي جرعة من أي بكتيريا التعسفي. بمجرد ثبوت العدوى، فإنه واضح ومباشر لقياس حركية انتشار البكتيريا أو التخليص، لتتبع وفيات المضيف، ومقايسة تحريض الجهاز المناعي المضيف. يمكن بسهولة الذباب المصابة التعرض للفحوصات المظهري الأخرى، بما في ذلك اختبارات الوظائف الفسيولوجية التي قد تشكل أو تكون على شكل من العدوى. الإجراءات المذكورة غير مكلفة، وتتطلب القليل نسبيا المعدات المتخصصة، وعلمت بسهولة، مما يجعلها قابلة للاستخدام في مشاريع متنوعة عبر مجموعة واسعة من البحث والتدريس مختبرات.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank the entire Lazzaro lab, and especially Susan Rottschaefer, for their help in both reviewing and testing these protocols. This is a product of their cumulative expertise. Work in the Lazzaro lab is supported by grants R01 AI083932 and R01 AI064950 from the US National Institutes of Health.
Materials
| Reagent | Company | Part Number |
| Incubator | Powers Scientific, Inc | DROS52SD |
| Paintbrush | ||
| CO2 Flypads | FlyStuff | 59-114 |
| CO2 | Airgas | CD FG50 |
| Drosophila rearing mix | ||
| 6 oz Square Bottom Bottles, polypropylene | Genesee Scientific | 32-130 |
| Nosterile Extra Large Cotton Balls | Fisher brand | 22-456-882 |
| Microscope | Olympus Corporation | SZ51 |
| Drosophila Vials polystyrene | VWR international | 89092-720 |
| Nosterile Large Cotton Balls | Fisher brand | 22-456-883 |
| 2L flask | VWR international | 89000-370 |
| Petri Dishes with Clear Lids, Raised Ridge; 100 . x 15 mm; | VWR international | 25384-302 |
| LB Agar, Miller | Difco | 244520 |
| Innoculing Loop | VWR international | 80094-488 |
| Rainin Clasic Pipettes in various sizes 0.1 µl to 2 µl, 2 µl to 20 µl, 20 µl to 200 µl, 100 µl to 1000 |
Rainin | PR-2 PR-20 PR-200 PR-1000 |
| Micropipette tips (assorted sizes) | VWR international | 30128-376 53503-810 16466-008 |
| Luria Broth Base, Miller | Difco | 241420 |
| Disposable Culture Tubes Borosilicate Glass | VWR international | 47729-576 |
| S-500 Orbital Shaker | VWR international | 14005-830 |
| centrifuge | VWR international | 37001-300 |
| PBS pH 7.4 10x | Invitrogen | 70011044 |
| SmartSpec 3000 Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2501 |
| Semimicrovolume Cuvettes | Bio-Rad | 223-9955 |
| Vertical Capillary Puller | Kopf Needle Pipette Puller | |
| 3.5'' Replacement glass Capillaries for Nanojet II | Drummond Sientific Company | 3-000-203-G/X |
| Nanoject II | Drummond Sientific Company | 3-000-204 |
| Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 |
| 10mL Syringe | BD | 309604 |
| Mineral Oil, White, light | Macron Fine Chemicals | 6358-10 |
| minutein pins | Fine Science Tools | 26002-10 |
| 1.5mL Microcentrifuge tubes; Seal Rite | USA Scientific Inc. | 1615-5500 |
| Motorized Pestle; Talboys Laboratory Stirrer | Troemner | 103 |
| Talboys High Throughput Homogenizer | OPS Diagnostics | 930145 |
| 5/32'' Grinding Balls | OPS Diagnostics | GBSS 156-5000-01 |
| Vortex Genie | Scientific indurstries inc. | G560 |
| Multichannel Pipettor (10uL-300uL) | Sartorius | 730360 |
| WASP2 Whitley Automated Spiral Plater | Microbiology International | |
| ProtoCOL automated colony counter / plate counter/ plate reader | Microbiology International | |
| TRIzol | Life Technologies | 15596-026 |
| qPCR tubes; Low-Profile 0.2 ml 8-Tube Strips | Bio-Rad | TLS0801 |
| qPCR caps; Optical Flat 8-Cap Strips | Bio-Rad | TCS0803 |
| RQ1 RNase-Free DNase | Promega | m610a |
| M-MLV Reverse Transcriptase | Promega | m170b |
| dNTPs | Promega | U1240 |
| Oligo-dT | IDT | |
| SsoAdvanced SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5260 |
| CFX Connect Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 185-5200 |
| RNasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2115 |
References
- Lemaitre, B., Hoffmann, J. The host defense of Drosophila melanogaster. Annual review of immunology. 25, 697-743 (2007).
- Dionne, M. S., Schneider, D. S. Models of infectious diseases in the fruit fly Drosophila melanogaster. Disease models & mechanisms. 1 (1), 43-9 (2008).
- Rutschmann, S., Jung, A. C., Hetru, C., Reichhart, J. M., Hoffmann, J. A., Ferrandon, D. The Rel protein DIF mediates the antifungal but not the antibacterial host defense in Drosophila. Immunity. 12 (5), 569-580 (2000).
- Ayres, J. S., Freitag, N., Schneider, D. S. Identification of Drosophila mutants altering defense of and endurance to Listeria monocytogenes infection. Genetics. 178 (3), 1807-1815 (2008).
- Cronin, S. J. F., et al. Genome-wide RNAi screen identifies genes involved in intestinal pathogenic bacterial infection. Science. 325 (5938), 340-343 (2009).
- Neyen, C., Bretscher, A. J., Binggeli, O., Lemaitre, B. Methods to study Drosophila immunity. Methods. , (2014).
- Dionne, M. S., Pham, L. N., Shirasu-Hiza, M., Schneider, D. S. Akt and FOXO dysregulation contribute to infection-induced wasting in Drosophila. Current biology CB. 16 (20), 1977-1985 (2006).
- McKean, K. a., Yourth, C. P., Lazzaro, B. P., Clark, A. G. The evolutionary costs of immunological maintenance and deployment. BMC evolutionary biology. 8 (1), 76 (2008).
- Kuo, T. -. H., Pike, D. H., Beizaeipour, Z., Williams, J. A. Sleep triggered by an immune response in Drosophila is regulated by the circadian clock and requires the NFkappaB Relish. BMC neuroscience. 11, 17 (2010).
- Panayidou, S., Ioannidou, E., Apidianakis, Y. Human pathogenic bacteria, fungi, and viruses in Drosophila: disease modeling, lessons, and shortcomings. Virulence. 5 (2), 253-269 (2014).
- Keebaugh, E. S., Schlenke, T. A. Insights from natural host–parasite interactions: The Drosophila model. Developmental & Comparative Immunology. 42 (1), 111-123 (2014).
- Howick, V. M., Lazzaro, B. P. Genotype and diet shape resistance and tolerance across distinct phases of bacterial infection. BMC evolutionary biology. 14 (1), 56 (2014).
- Babin, A., Kolly, S., Kawecki, T. J. Virulent bacterial infection improves aversive learning performance in Drosophila. Brain, behavior, and immunity. , (2014).
- Chambers, M. C., Song, K. H., Schneider, D. S. Listeria monocytogenes infection causes metabolic shifts in Drosophila melanogaster. PLoS ONE. 7 (12), e50679 (2012).
- Fellous, S., Lazzaro, B. P. Larval food quality affects adult (but not larval) immune gene expression independent of effects on general condition. Molecular ecology. 19 (7), 1462-1468 (2010).
- Stone, E. F., Fulton, B. O., Ayres, J. S., Pham, L. N., Ziauddin, J., Shirasu-Hiza, M. M. The circadian clock protein timeless regulates phagocytosis of bacteria in Drosophila. PLoS pathogens. 8 (1), e1002445 (2012).
- Chambers, M. C., Jacobson, E., Khalil, S., Lazzaro, B. P. Thorax injury lowers resistance to infection in Drosophila melanogaster. Infection and immunity. , (2014).
- Rich, J. T., Neely, J. G., Paniello, R. C., Voelker, C. C. J., Nussenbaum, B., Wang, E. W. A practical guide to understanding Kaplan-Meier curves. Otolaryngology–head and neck surgery official journal of American Academy of Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 143 (3), 331-336 (2010).
- Sokal, R. R., Rohlf, F. J., Freeman, W. H. . Biometry. , (1995).
- Frydman, H. Wolbachia bacterial infection in Drosophila. Journal of visualized experiments JoVE. (2), 158 (2007).
- Kuo, T. -. H., Handa, A., Williams, J. A. Quantitative measurement of the immune response and sleep in Drosophila. Journal of visualized experiments JoVE. (70), e4355 (2012).
- Vodovar, N., et al. Drosophila host defense after oral infection by an entomopathogenic Pseudomonas species. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (32), 11414-11419 (2005).
- Nehme, N. T., et al. A model of bacterial intestinal infections in Drosophila melanogaster. PLoS pathogens. 3 (11), e173 (2007).
- Jaenike, J., Polak, M., Fiskin, A., Helou, M., Minhas, M. Interspecific transmission of endosymbiotic Spiroplasma by mites. Biology. 3 (1), 23-25 (2007).
- Kanbar, G., Engels, W. Ultrastructure and bacterial infection of wounds in honey bee ( Apis mellifera) pupae punctured by Varroa mites. Parasitology research. 90 (5), 349-354 (2003).
