Systemische bacteriële infectie en afweer Phenotypes in<em> Drosophila melanogaster</em

1. Verzamelen en Bereid Flies Achter D. melanogaster onder de gewenste experimentele omstandigheden. Zorg ervoor dat u de vliegen overcrowd tijdens de opfok en zorg ervoor dat larvale dichtheden consistent behandelingen, omdat milieu-omstandigheden tijdens de larvale stadium diepgaand kunnen beïnvloeden afweer fenotypes tijdens volwassen stadium. 15 Verzamel experimentele vliegt 0-3 dagen na Eclosion van de pupal geval en over te brengen naar vers medium. Huis verzameld vliegen op een gewenste temperatuur (temperaturen tussen 22 ° C en 28 ° C zijn in het algemeen geschikt) totdat zij de leeftijd 5 – post-verpopping 7 dagen. NB: Dit laat voldoende tijd voor de vliegen om metamorfose voltooien en word volwassen volwassenen, maar is goed voor veroudering begint. Sorteer de gewenste aantal vliegen in een apart flesje voorafgaand aan infectie, opnieuw zorg ervoor dat overbevolking te voorkomen. OPMERKING: Alleen males geïnfecteerd in deze demonstratie, maar is evenzeer mogelijk vrouwtjes gebruik van de beschreven procedure infecteren. 2. Cultuur en Bereid Bacteriën Bereid een meester plaat van de gekozen bacteriën ten minste 2 dagen voor infectie. Streak de bacteriën uit een 15% glycerol gedurende onbeperkte tijd bewaard bij -80 ° C. Bewaar de meester plaat staan ​​bij 4 ° C gedurende maximaal 2 weken. Altijd streak de meester platen direct uit de bevroren glycerol voorraad. Vermijd seriële passage van de bacteriën uit de plaat tot het bord, zoals herhaalde passage in cultuur kan veroorzaken bacteriën verzwakte virulentie evolueren. OPMERKING: Dit voorbeeld maakt gebruik van Providencia rettgeri en Escherichia coli. Gebruik de volgende procedure om een ​​bacteriële suspensie te bereiden voor injectie. Kweek een cultuur 2 ml van bacteriën door het enten steriel medium met een enkele kolonie geïsoleerd van de meester plaat. Groeien de bacteriën stationaire fase (bv </em> O / N groei bij 37 ° C). OPMERKING: Zowel P. rettgeri en E. coli goed groeien in Luria Broth bij temperaturen 20-37 ° C onder zachtjes schudden. Nadat de kweek de stationaire fase bereikt voorzichtig pellet cellen van ca. 600 ul van de cultuur in een tafelblad centrifuge (3 min bij 5.000 xg), gooi het supernatant en resuspendeer de bacteriën in ong. 1000 uit steriel met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCI, 10 mM Na 2PO 4, 1,8 mM KH 2PO 4, pH = 7,4). Verdun de cellen geresuspendeerd in steriele PBS tot een optische dichtheid (OD) geschikt zijn voor de bacterie wordt gebruikt, gemeten met een spectrofotometer als de extinctie bij 600 nm te bereiken. Gebruik deze schorsing aan de vliegen te infecteren. Opmerking: A 600 = 0,1 of 1,0 respectievelijk overeen met ongeveer 10 8 en 10 9 Providencia rettgeri en E. coli per ml. Omdat zowel live eennd dode bacteriën bijdragen aan optische dichtheid, is het belangrijk cultures begin van stationaire fase oogsten voor bacteriële lichamen verzamelen en vervormen het verband tussen de optische dichtheid en het aantal levensvatbare bacteriën die tijdens infectie. 3. Infect the Flies OPMERKING: Omdat Drosophila immuniteit wordt beïnvloed door circadiane ritme, is het belangrijk om infecties te voeren op een soortgelijke tijdstip tussen experimentele replicaten 16. 3.1) Met behulp van een Nanoinjector Bereid de glazen naalden voor infectie. Bereid een glazen naald door te trekken een borosilicaatglas capillair met behulp van een micropipet trekker. Behulp van een tang, afbreken van de punt van de naald een opening van ongeveer 50 urn diameter creëren uitwerpen van vloeistof mogelijk. Monteer de injector. Plaats de afdichtende O-ring en de witte spacer (grote kuiltje naar buiten gericht) op de metalen zuiger. Vul het glas naald met minerale olie met behulp van een spuit met een 30 G naald. Plaats de gevulde glazen naald door de kraag en plaats de grotere O-ring rond de basis, ongeveer 1 mm vanaf het stompe einde van de naald. Schuif de naald op de metalen zuiger en voorzichtig schroef op de kraag tot veilig. Werp de meeste van de minerale olie uit de injector, maar zorg ervoor dat er nog een kleine hoeveelheid olie in de naald op te treden als een barrière tussen de injector en de bacteriesuspensie. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de minerale olie of bacteriële suspensie, of tussen de twee vloeistoffen. Stel de injector op het gewenste volume voor injectie (tussen 9 en 50 nl nl). Genereer verwonden controles. Vul het verstuivernaald met steriele PBS door voorzichtig de tip van de capillaire naald in een buis van de media en pressing de "vullen" knop op de injector. OPMERKING: Steriele bacteriële groeimedia kan ook een verwonding bestrijding wanneer het experiment vereist injectie van bacteriën gesuspendeerd in het kweekmedium. Omdat bacteriële groeimedia bevat componenten die het immuunsysteem stimuleren of andere effecten op de gastheer, een inerte drager, zoals PBS voorkeur. Verdoven het gewenste aantal vliegen onder een lichte stroom van CO 2. Injecteer de vliegen in de voorste buik op het ventrolaterale oppervlak met steriele PBS. Opmerking: Het is ook mogelijk om vliegen op andere plaatsen, zoals de sternopleural plaat van de thorax te injecteren, maar het is belangrijk om de injectieplaats consistenter elk experiment te houden 17. Plaats geïnjecteerd ongedierte in verse flesjes nieuwe medium, legt de flesjes op hun kant tot alle vliegen hersteld zijn van de verdoving te voorkomen dat de vliegen raakt vast aan het eten. <br /> NB: Het wordt aanbevolen om de PBS controle vliegen injecteren alvorens te injecteren bacteriën om experimentele vliegen zodat dezelfde naald kan worden gebruikt voor zowel behandelingen. Het is niet altijd mogelijk om dezelfde naald te gebruiken voor een hele experiment. In dat geval kan het wenselijk zijn om registreren welke naald werd gebruikt waarmee vliegt en naald identiteit als experimentele factor statistische analyse eveneens zijn. Injecteer de bacteriële ziekteverwekker. Werp de resterende steriele media uit de injector en vul dezelfde naald met de bacteriële suspensie. Herhaal de bovenstaande procedure (3.1.3), nu het injecteren van de vliegen met de bacteriële suspensie bereid in procedure 2.2. 3.2) Met Septic Pinprick Bereid de naald voor prikken. Smelt het einde van een 200 ul micropipet tip en plaats een 0,15 mm insect minutien pen in het gesmolten plastic. Laat de plastic stollen such waar de pen wordt bevestigd met ongeveer 0,5 cm van de pen uitstrekt van de kunststof. Genereer verwonden controles. Verdoven het gewenste aantal vliegen onder een lichte stroom van CO 2. Prik de vliegen in de sternopleural plaat van de thorax met de naald, het vermijden van de aanhechtingsplaatsen van de vleugels en de benen. Indien nodig, verwijder voorzichtig vliegen uit de minutien pin met zachte tang. Opmerking. Het is ook mogelijk de vliegen op andere plaatsen, zoals de anterieure buik op het ventrolaterale oppervlak prikken, maar het is belangrijk om de injectieplaats consistenter elk experiment te houden 17 prikken door de cuticula van het abdomen neigt more moeilijker dan prikken van de thorax en daardoor minder vaak. Plaats de geprikt vliegen in een schoon flesje nieuwe fly medium, legt de flacon op de zijkant zodat alle vliegen hersteld zijn van de verdoving naar de vliegen uit BE voorkomingkomst vast aan het voedsel. Introduceer de bacteriële infectie. Verdoven het gewenste aantal vliegen onder een lichte stroom van CO 2. Prik elke vliegen op dezelfde locatie als de media controles, dompelen de punt van de pen in de bacteriële suspensie bereid in procedure 2.2 voordat prikt elke vliegen. Plaats de geprikt vliegen in een schoon flesje nieuwe fly medium, legt de flacon op de zijkant zodat alle vliegen hersteld zijn van de verdoving te voorkomen dat de vliegen raakt vast aan het eten. 3.3) Beoordelen van de Infectious Dose Geleverd Infect een aantal vliegen zoals hierboven in beide procedures 3.1 en 3.2, maar in plaats van terug de vliegen om voedsel flacon te herstellen van de anesthesie is zet vliegen in een microcentrifuge buis op ijs. Voeg 250 ul PBS aan elk buisje toe en homogeniseer de vliegen hetzij met behulp van een stamper of een bead beater. </ Li> Plate het homogenaat op een LB agar plaat, hetzij met behulp van een spiraal Plater of een seriële verdunning. Om plaat middels seriële verdunning breng elke vlieg homogenaat bij de eerste rij van een 96 putjesplaat. Vul elk putje van de resterende rijen 90 ui PBS. Met behulp van een multichannel pipet, nemen 10 ul van de eerste rij met vliegen homogenaat en afzien in de tweede rij. Pipet op en neer ten minste 10 keer om grondig te mengen, en neem vervolgens 10 ul en over te dragen aan de derde rij. Herhaal deze procedure met de andere rijen. Vanaf de onderste rij (de meeste verdunde bacteriën schorsing), gebruik dan de multichannel pipet tot 10 pi uit elk putje en deposito mee op een LB plaat, zorg dat de monsters worden afgeleverd als afzonderlijke plekken die elkaar niet raken. Herhaal dit totdat alle putten zijn bemonsterd uit elke rij, doseren in afnemende volgorde van verwatering op de LB plaat. </li> Laat de plaat bij kamertemperatuur tot de plekken volledig zijn gedrenkt in de LB plaat. Opmerking: Het drogen van de LB plaat gedurende enkele dagen bij kamertemperatuur voorafgaand aan gebruik wordt aanbevolen dat de vloeistof wordt geabsorbeerd, het minimaliseren van de kans op onbedoeld contact tussen monster spots. Incubeer de platen O / N, het verzorgen van de platen niet te overwoekeren zo kolonies klein en discreet blijven. OPMERKING: Afhankelijk van de groei van bacteriën medium en incubatietemperatuur gebruikt, kan kolonies afgeleid van de vlieg endogene darmflora uiteindelijk verschijnen op het bord. Echter, de meeste bacteriën die op pathogene infectie veel sneller groeien dan de darmflora op LB-agar bij 37 ° C. Verwijder platen uit de incubator als de experimentele bacteriën zichtbare kolonies zijn gegroeid (gewoonlijk 8-12 uur), maar vóór Drosophila darmflora kolonies verschijnen (ongeveer 36 uur). Voor langzaam groeiende experimentele bacteriën, gebruik maken van een selectieveantibioticum in de LB agar elke kolonies van de darmflora te verwijderen. Tel het aantal kolonies per homogenaat. Voor spiraalvormige platen, de kolonies die groeien onder toepassing van een geautomatiseerde kolonieteller welke schatten bacteriële verontreiniging per ml homogenaat basis van het aantal en de positie van de kolonies op de plaat. OPMERKING: Spiraalvormige tellingen meest nauwkeurig wanneer de bacteriële concentratie in het traject van 5 x 02-05 oktober 4 x 10 bacteriën per ml. Voor spot platen, handmatig de koloniën voor elke vlieg uit welke verdunning bevat 30 tellen – 300 kolonies en het berekenen van het aantal bacteriën per ml originele homogenaat. 4. karakteriseren Survivorship van infectie Assay mortaliteit na de injectie. Plaats geïnfecteerde vliegen en gewonden controles in vers flesjes en onderhouden in een incubator bij een gewenste temperatuur (25 ° C met een 0:12 light: donker cyclus wordt aanbevolen). Plaats nooit meer dan 15 vliegen in één flesje als het moeilijk wordt om meer dan 15 levende vliegen tellen. Tel het aantal levende en dode vliegen elke dag, of vaker indien nodig. Om de kwaliteit van het voedsel te behouden, draai de vliegen om nieuwe voedsel op een regelmatig schema. Als de flacon bevat alleen mannen, overbrengen naar verse flesjes om de drie dagen. Als de flacon bevat vrouwtjes, over te dragen aan verse flesjes per twee dagen, omdat de larven nageslacht het voedsel vloeibaar te maken, waardoor het risico dat de volwassen vliegen kan vast komen te zitten en dat resulteert in overschat tarieven van de sterfte als gevolg van infectie. Statistisch analyseren van de gegevens. Plot overleven als een Kaplan-Meier curve, die de kans dat een individu zal overleven tot een gemeten tijd-punt na de injectie. 18 voor survival curves die niet kruisen, voert paarsgewijze vergelijkingen met behulp van een Log-Rank T geeftest (ook wel Mantel Cox Test) of meer complexe analyses met behulp van een Cox proportionele risico model, waarin verschillende factoren en hun interacties kunnen nemen uitvoeren. Voor overlevingscurven die elkaar kruisen, het uitvoeren van een gestratificeerd Cox analyse. 17 5. Assay Bacteriële Load Post-infectie Meet bacteriële verontreiniging. Op een voorgeschreven tijd na de injectie, herhaalt u de procedure die wordt gebruikt om infectieuze dosis te evalueren om bacteriële belasting in de loop van de infectie te bepalen (zie protocol 3.3). LET OP: Als u de spiraal Plater, verdunnen homogenaten zodat de bacteriële suspensie binnen een bereik van 1000 valt – 100.000 bacteriën per ml. Analyseer de gegevens. Als hoeveelheid bacteriën niet normaal, hetzij transformeren de gegevens beter benaderen normaalverdeling of data met behulp van niet-parametrische statistische analyse (bijvoorbeeld Mann-Whitney U test) geanalyseerd. Gebruik een Box-Cox analyse find de optimale transformatie; natuurlijke log of base -10 log transformaties zijn vaak effectief. 19 Als de gegevens voldoende normaal verdeeld en er zijn slechts twee behandelingen worden gecontrasteerd, een t-test uitgevoerd om te bepalen of de twee behandelingen resulteren in verschillende gemiddelde bacteriële belastingen. Als er meerdere experimentele variabelen of andere potentieel voorspellende factoren Gebruik Variantie-analyse (ANOVA) om te bepalen welke factoren significante voorspellers van bacteriële verontreiniging zijn. 19 6. Assay Transcriptionele Activering van Immune System Genes Om grof visualiseren immuunactivatie na infectie, infecteren transgene vliegen die groen fluorescent proteïne (GFP) onder de controle van een promoter van een antimicrobieel peptide-gen tot expressie zoals eerder beschreven. 18 Bekijk de besmette vliegen onder een fluorescentie-microscoop in staat is; GFP inductie moet visib gewordenle in het vet lichaam binnen de eerste 6 – 10 uur na infectie. Voor nauwkeurigere kwantificering van immuunactivatie gebruik van kwantitatieve PCR op cDNA template (qRT-PCR) de overvloed van antimicrobiële peptiden gentranscripten te meten. OPMERKING: De expressie van immune genen worden gemeten op elk tijdstip na (of vóór) infectie. In het algemeen, inductie van immune genexpressie begint ongeveer 4 uur na injectie en verhogingen in de volgende 24 uur. Verdoven vliegen met behulp van CO 2. Plaats 15 vliegt in een microfuge buis voor elke RNA-extractie. OPMERKING: Het wordt aanbevolen om ten minste drie identieke monsters te verzamelen voor elke behandeling conditie. Uittreksel RNA van de vliegen en het genereren van de eerste streng cDNA met behulp van elk van een aantal standaardprocedures of commerciële kits. WINKEL RNA bij -80 ° C. WINKEL cDNA bij -20 ° C voor een periode van enkele weken en bij -80 ° C voor lange termijn opslag. Voorafgaand aan de RNA-extractie, op te slaan fligt bij -80 ° C. Voer kwantitatieve PCR (qPCR) op doelgenen van belang met het cDNA als matrijs. Zie Tabel 1 voor de primersequenties voor de antibacteriële peptide genen Diptericin A, Drosomycin, defensine, Attacin A en Metchnikowin en het huishoudelijk control rp49 gen (ook bekend als rpL32) amplificeren. LET OP: De genen die coderen voor de antimicrobiële peptiden Diptericin A en Drosomycin zorgen voor een zeer goede uitlezingen van D. melanogaster immuunactiviteit voornamelijk veroorzaakt door de Imd en Toll paden, respectievelijk. Om te controleren voor sample-to-sample variatie in RNA opbrengst en de efficiëntie van reverse transcriptie, standaardiseren geregistreerde expressie van doelgenen tegen een referentie housekeeping gen waarvan de expressie niet verwacht veranderen infectie zoals rp49 (ook bekend als RPL 32). Analyseer de gegevens. <ol> Voor grove benadering van expressieverschillen Bereken de verhouding van de starthoeveelheid (SQ) waarde uit de tests gen (bijvoorbeeld Diptericin A) ten opzichte van de referentieoplossing gen SQ waarde (bijvoorbeeld, rp49) voor elk monster (berekend als SQ – DPTA / SQ – rp49). Schaal deze verhoudingen om een ​​baseline controle behandeling, zoals een niet-geïnfecteerde handling controle. Arbitrair de controle expressie niveau dat gelijk is aan 1,0 en visualiseren experimentele behandelingen als relatieve fold veranderingen. Schat de SQ waarde voor elk gen tegen een standaard curve gegenereerd uit een verdunningsreeks van bekende-hoeveelheid cDNA. OPMERKING: Statistische analyse van verhoudingen kan ingewikkeld zijn, zodat deze aanpak is beter voor snelle aanpassing dan voor een grondige analyse. Als de PCR-efficiëntie is laag, het ontwerpen van nieuwe primers PCR kinetiek te verbeteren, indien mogelijk. Voor qPCR reacties met bijna perfecte efficiency (adoubling van PCR-product elke cyclus), kan de drempel cyclus (C T) worden vervangen door de SQ waarde. Voor eenvoudige experimenten met optimaal efficiënte amplificatie, kunnen gegevens worden geanalyseerd met de ΔΔC T werkwijze. 19 Voor elk monster aftrekken van de CT-waarde van de referentie-gen (bijvoorbeeld, rp49) vanaf het C T van de proef gen (bijv., Diptericin A) een ΔC T leveren. Dan trekt u de ΔC T van de basislijn controle van de ΔC T voor elke experimentele monster naar een ΔΔC T-waarde voor elk monster opleveren; Dit ΔΔC T is een indicatie van de relatieve verschillen in genexpressie niveaus tussen de behandelingen, waarbij 2 (-ΔΔCT) benadert de vouw verandering in expressie. Opmerking: Deze analyse kan slecht misestimate veelvoudverandering in de expressie van het doelgen als de PCR van ofwel het testgen of de referentiegen heeft een laag rendement. Voor de meest rigoureuze analyse uitvoeren variantieanalyse (ANOVA) met de geschatte expressie van het testgen (bijv Diptericin A) als de responsvariabele en geschatte expressie van het controle gen (bijv rp49) en andere experimentele factoren als verklarende variabelen. OPMERKING: Deze aanpak is relatief robuust tot inefficiëntie in PCR-amplificatie en maakt analyse van meer ingewikkelde experimentele ontwerpen.