Sistemica infezione batterica e immunitario Difesa fenotipi in<em> Drosophila melanogaster</em

1. Raccogliere e preparare Flies D. posteriore melanogaster nelle condizioni sperimentali desiderati. Fare attenzione a non affollare linea durante l'allevamento e fare in modo che le densità larvali sono coerenti tra i trattamenti, dal momento che le condizioni ambientali durante la fase larvale può influenzare profondamente fenotipi di difesa immunitaria durante la fase adulta. 15 Raccogliere mosche sperimentali 0-3 giorni dopo eclosion dal caso pupa e trasferirli su terreno fresco. Casa in linea raccolti alla temperatura desiderata (temperatura compresa tra 22 ° C e 28 ° C sono generalmente adatte) fino a quando non sono di età 5-7 giorni dopo eclosion. NOTA: In questo modo il tempo necessario per le mosche per completare la metamorfosi e diventare adulti maturi, ma è ben prima che inizi la senescenza. Ordinare il numero desiderato di mosche in un flacone separato prima di infezione, di nuovo facendo attenzione a evitare il sovraffollamento. NOTA: solo MAles sono infettati in questa dimostrazione, ma è ugualmente possibile infettare femmine utilizzando la procedura descritta. 2. Cultura e preparare batteri Preparare un piatto principale dei batteri scelti almeno 2 giorni prima della infezione. Streak i batteri da un stock di glicerolo 15% conservati indefinitamente a -80 ° C. Conservare il piatto principale a 4 ° C per un massimo di due settimane. Sempre striscia le piastre di master direttamente dal congelato stock di glicerolo. Evitare il passaggio in serie di batteri da lastra a lastra, come passaggio ripetuto in cultura può portare i batteri ad evolversi virulenza attenuata. NOTA: Questo esempio fa uso di Providencia rettgeri ed Escherichia coli. Utilizzare la seguente procedura per preparare una sospensione batterica iniettabile. Grow coltura di 2 ml di batteri inoculando mezzo sterile con una singola colonia isolata dalla piastra master. Crescere i batteri a fase stazionaria (ad esempio, </em> O / N crescita a 37 ° C). NOTA: Entrambi P. rettgeri ed E. coli crescono bene in Luria Broth a temperature 20-37 ° C agitando delicatamente. Una volta che la cultura ha raggiunto la fase stazionaria, pellet delicatamente le cellule da ca. 600 ml di cultura in una centrifuga da tavolo (3 min a 5.000 xg), scartare il surnatante e risospendere i batteri in ca. 1,000 ml di soluzione salina tamponata di fosfato sterile (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 PO 4, 1.8 mM KH 2 PO 4, pH = 7,4). Diluire le cellule risospese in PBS sterile per ottenere una densità ottica (OD) appropriati per il batterio utilizzato, misurata con uno spettrofotometro l'assorbanza a 600 nm. Con tale sospensione per infettare le mosche. NOTA: A 600 = 0,1 o 1,0 corrisponde rispettivamente a circa 10 e 8 10 9 Providencia rettgeri o E. coli per ml. Perché entrambi vivono unand batteri morti contribuiscono alla densità ottica, è importante raccogliere culture presto fase stazionaria prima cadaveri batteriche accumulano e falsare la relazione tra la densità ottica e il numero di batteri vitali introdotte durante l'infezione. 3. Infettare le mosche NOTA: Come Drosophila immunità è influenzata dal ritmo circadiano, è importante eseguire le infezioni in un momento simile di giorno in tutto replicati sperimentali 16. 3.1) Con un Nanoinjector Preparare gli aghi di vetro per l'infezione. Preparare un ago di vetro tirando un capillare di vetro borosilicato con un estrattore micropipetta. Utilizzando pinze, rompere la punta dell'ago per creare un'apertura di circa 50 micron di diametro per permettere l'espulsione di liquido. Montare l'iniettore. Posizionare la guarnizione O-ring e poi la sp biancoacer (grande fossetta rivolta verso l'esterno) sul pistone di metallo. Riempire l'ago di vetro con olio minerale con una siringa con un ago da 30 G. Mettere l'ago di vetro riempito attraverso il collare e quindi inserire l'O-ring grande attorno alla sua base, circa 1mm dalla punta smussata dell'ago. Far scorrere l'ago sulla stantuffo di metallo e avvitare delicatamente sul colletto fino sicura. Estrarre maggior parte dell'olio minerale dall'iniettore, ma assicurarsi che non vi è ancora una piccola quantità di olio in dell'ago di agire come una barriera tra l'iniettore e la sospensione batterica. Assicurarsi che non vi siano bolle d'aria all'interno della olio minerale o sospensione batterica, oppure tra i due liquidi. Impostare l'iniettore al volume desiderato per l'iniezione (tra 9 e 50 nl nl). Generare ferendo controlli. Riempire l'ago iniettore con PBS sterile inserendo con attenzione la punta dell'ago in un tubo capillare dei media e pressil tasto "fill" sull'iniettore. NOTA: Sterile terreni di crescita batterica può essere utilizzato anche un controllo ferendo se l'esperimento richiede iniezione di batteri in sospensione nel loro mezzo di crescita. Tuttavia, perché i media crescita batterica contiene componenti che possono stimolare il sistema immunitario o avere altri effetti sull'ospite, un vettore inerte come PBS è preferibile. Anestetizzare il numero desiderato di mosche sotto un flusso luminoso di CO 2. Iniettare linea nell'addome anteriore sulla superficie ventrolaterale con la PBS sterile. NOTA: È anche possibile iniettare mosche in altri siti, come la piastra sternopleural del torace, ma è importante mantenere il sito di iniezione costante all'interno di ogni esperimento 17. Mettere mosche iniettati in fiale fresche con nuovo mezzo, ponendo le fiale dalla loro parte fino a quando tutte le mosche hanno recuperato dalla anestesia per evitare che le mosche di diventare bloccato al cibo. <br /> Nota: Si raccomanda di iniettare in linea di controllo PBS prima di iniettare batteri di mosche sperimentali così lo stesso ago può essere utilizzato per entrambi i trattamenti. Non sarà sempre possibile utilizzare lo stesso ago per un intero esperimento. In tal caso, può essere desiderabile per registrare quale ago è stato utilizzato con cui mosche e includere identità ago come un fattore sperimentale nell'analisi statistica. Iniettare l'agente patogeno batterico. Espellere i restanti mezzi sterile dall'iniettore e riempire lo stesso ago con la sospensione di batteri. Ripetere la procedura di cui sopra (3.1.3), ora l'iniezione in linea con la sospensione batterica preparato in procedura 2.2. 3.2) Con Septic Pinprick Preparare l'ago per puntura. Sciogliere il fine di una punta micropipetta 200 microlitri e inserire un perno insetto minutien 0,15 millimetri nella plastica fusa. Lasciare che la plastica solidificare such che il perno è tenuto in posizione con circa 0,5 cm di perno che si estende dalla plastica. Generare ferendo controlli. Anestetizzare il numero desiderato di mosche sotto un flusso luminoso di CO 2. Bucherellare linea nella piastra sternopleural del torace con l'ago, evitando i siti di fissaggio delle ali e le gambe. Se necessario, rimuovere delicatamente le mosche dal perno minutien con pinze morbide. NOTA:. E 'anche possibile per pungere linea in altri siti, come l'addome anteriore sulla superficie ventrolaterale, ma è importante mantenere il sito di iniezione costante all'interno di ciascun esperimento 17 pizzicore attraverso la cuticola dell'addome tende ad essere più difficile di puntura del torace ed è quindi meno comune. Mettere in linea dritte in un flaconcino fresco con nuovo mezzo mosca, posa la fiala sul suo lato fino a quando tutti i mosche hanno recuperato dalla anestesia per evitare che le mosche bevenendo attaccato al cibo. Introdurre l'infezione batterica. Anestetizzare il numero desiderato di mosche sotto un flusso luminoso di CO 2. Prick ogni volano nella stessa posizione i controlli multimediali, immergendo la punta del perno nella sospensione batterica preparato in procedura 2.2 prima puntura ogni mosca. Mettere in linea dritte in un flaconcino fresco con nuovo mezzo mosca, posa la fiala sul suo lato fino a quando tutti i mosche hanno recuperato dalla anestesia per evitare che le mosche di diventare bloccato al cibo. 3.3) Valutare il infettiva dose erogata Infettare una serie di mosche come sopra descritto in entrambe le procedure 3.1 o 3.2, solo che invece di restituire i mosche al cibo fiala di recuperare da anestesia, collocare ogni volare in una provetta su ghiaccio. Aggiungere 250 microlitri di PBS in ogni provetta e omogeneizzare in linea sia con un pestello o un battitore tallone. </ Li> Piatto l'omogeneizzato su una piastra di agar LB, sia utilizzando un placcatore spirale o una diluizione seriale. Per piastra con diluizione seriale, trasferire ogni omogeneizzato volo per la prima fila di una piastra ben 96. Riempire ciascun pozzetto delle rimanenti righe con 90 ml di PBS. Utilizzando una pipetta multicanale, prendere 10 ml dalla prima riga contenente volare omogeneizzato ed erogare in seconda fila. Pipetta su e giù per almeno 10 volte per mescolare accuratamente, e poi prendere 10 ml e trasferire alla terza fila. Ripetere questa procedura utilizzando le righe rimanenti. A partire dalla prima fila in basso (più diluito batteri sospensione), utilizzare la pipetta multicanale a prendere 10 ml di ogni bene e di deposito su una piastra LB, facendo attenzione che i campioni vengano erogate come macchie distinte che non si toccano l'un l'altro. Ripetere l'operazione fino a quando tutti i pozzetti sono stati campionati per ogni fila, li medicinale, al fine di diluizione decrescente sulla piastra LB. </li> Lasciare la piastra a temperatura ambiente fino a quando le macchie sono completamente inzuppato nella piastra LB. NOTA: Essiccamento piastra LB per alcuni giorni a temperatura ambiente prima dell'uso si raccomanda di assicurare che il liquido viene facilmente assorbito, minimizzando la possibilità di contatto accidentale tra punti campione. Incubare le piastre O / N, facendo attenzione a non invadere i piatti così colonie rimangono piccolo e discreto. NOTA: A seconda del mezzo di crescita e di incubazione di temperatura batterico usato, colonie derivate da endogena flora intestinale della mosca possono finalmente apparire sul piatto. Tuttavia, la maggior parte dei batteri usati per l'infezione patogena crescono molto più velocemente della flora intestinale su LB agar a 37 ° C. Rimuovere le piastre dal termostato quando i batteri sperimentali sono cresciute colonie visibili (in genere 8-12 ore), ma prima di Drosophila colonie gut microbiota appaiono (circa 36 ore). Per crescita lenta batteri sperimentali, utilizzare un selettivoantibiotico nel agar LB per rimuovere eventuali colonie dalla flora intestinale. Contare il numero di colonie per ogni omogeneizzato. Per piastre a spirale, contare le colonie che crescono usando un contatore di colonie automatizzato che può stimare la carica batterica per ml di omogenato in base al numero e la posizione delle colonie sulla piastra. NOTA: conta spirale sono più accurate quando la concentrazione batterica è nell'intervallo di 5 x 02-5 ottobre x 10 4 batteri per ml. Per le lastre piatte, contare manualmente le colonie per ogni volo da qualsiasi diluizione contiene 30-300 colonie e calcolare il numero di batteri per ml di omogenato originale. 4. Caratterizzare Survivorship di infezione Mortalità Assay post-iniezione. Inserire mosche infetti e controlli feriti in fiale freschi e mantenere in termostato a una temperatura desiderata (25 ° C con un 12:12 ligHT: è consigliato ciclo scuro). Non mettere più di 15 mosche in un singolo flaconcino come diventa difficile contare più di 15 mosche viventi. Contare il numero di vivi e morti mosche ogni giorno, o più frequentemente se necessario. Al fine di mantenere la qualità del cibo, capovolgere le mosche al nuovo cibo a intervalli regolari. Se il flacone contiene solo i maschi, trasferirli fiale fresche ogni tre giorni. Se il flacone contiene femmine, trasferimento fiale freschi ogni due giorni perché la progenie larvale si liquefare il cibo, aumentando il rischio che le mosche adulte possono bloccarsi e conseguente tassi sopravvalutato di mortalità a causa di un'infezione. Statisticamente analizzare i dati. Sopravvivenza Plot come una curva di Kaplan-Meier, che indica la probabilità che un individuo sopravviverà ad un time-point dopo l'iniezione misurato. 18 Per le curve di sopravvivenza che non attraversano, eseguire confronti a coppie con un log-rank Test (chiamato anche Mantel Cox Test) o di eseguire analisi più complesse utilizzando un Cox proporzionale pericoli del modello, che può comprendere diversi fattori e le loro interazioni. Per le curve di sopravvivenza che attraversano, eseguire un'analisi stratificata Cox. 17 5. prova batterica carico post-infezione Misurare carica batterica. Ad una post-iniezione tempo prescritto, ripetere la procedura usata per valutare la dose infettiva di determinare carica batterica nel corso dell'infezione (vedi protocollo 3.3). NOTA: Se si utilizza il plater spirale, diluire omogenati in modo che la sospensione batterica rientra in un intervallo di 1.000 – 100.000 batterica per ml. Analizzare i dati. Se carica batterica non è normale, o trasformare i dati per approssimare meglio una distribuzione normale o analizzare i dati utilizzando non parametrico analisi statistica (ad esempio test di Mann-Whitney). Utilizzare una analisi Box-Cox per find la trasformazione ottimale; logaritmo naturale o di base -10 trasformazioni di registro sono spesso efficaci. 19 Se i dati sono sufficientemente distribuiti normalmente e ci sono solo due trattamenti contrastato, eseguire un t-test per determinare se i due trattamenti determinano differenti cariche batteriche medi. Se ci sono più variabili sperimentali o ad altri fattori potenzialmente predittivi, usare analisi della varianza (ANOVA) per determinare quali fattori sono predittori significativi di carica batterica. 19 6. Tenore trascrizionale attivazione di geni del sistema immunitario Per visualizzare grossolanamente attivazione immunitaria dopo l'infezione, infettare moscerini transgenici che esprimono la proteina fluorescente verde (GFP) sotto il controllo di un promotore di un gene peptide antimicrobico come precedentemente descritto. 18 Guarda le mosche infette sotto un microscopio a fluorescenza con capacità; Induzione GFP dovrebbe diventare visible nel corpo grasso all'interno del primo 6 – 10 da ore dopo l'infezione. Per la quantificazione più precisa di attivazione del sistema immunitario, utilizzare la PCR quantitativa cDNA (qRT-PCR) per misurare l'abbondanza di antimicrobici trascritti genici peptide. NOTA: L'espressione dei geni immunitari può essere misurato in qualsiasi momento dopo (o prima) infezione. In generale, l'induzione dell'espressione genica immunitario inizia circa 4 ore dopo l'iniezione e aumenta nel prossimo 24 hr. Anestetizzare le mosche con CO 2. Mettere 15 mosche in una provetta per microcentrifuga per ogni estrazione di RNA. NOTA: Si raccomanda di raccogliere almeno tre campioni replicati per ogni condizione di trattamento. Estrarre RNA dalle mosche e generare cDNA primo filamento utilizzando qualsiasi di una serie di procedure standard o kit commerciali. Conservare l'RNA a -80 ° C. Conservare cDNA a -20 ° C per periodi di alcune settimane ed a -80 ° C per una conservazione a lungo termine. Prima di estrazione di RNA, negozio fsi trova a -80 ° C. Eseguire la PCR quantitativa (qPCR) su geni bersaglio di interesse utilizzando il cDNA come modello. Fare riferimento alla Tabella 1 per le sequenze dei primer per amplificare i geni peptidi antibatterici Diptericin A, Drosomycin, defensin, Attacin A, e Metchnikowin così come il rp49 gene di controllo housekeeping (noto anche come rpL32). NOTA: I geni che codificano per i peptidi antimicrobici Diptericin A e Drosomycin forniscono ottime letture di D. melanogaster attività immunitaria indotta principalmente attraverso le vie IMD e Toll, rispettivamente. Per controllare per campione a campione variazione resa RNA e l'efficienza della trascrizione inversa, uniformare l'espressione di geni bersaglio registrata contro un gene housekeeping riferimento la cui espressione non dovrebbe cambiare con infezioni quali rp49 (noto anche come Rpl 32). Analizzare i dati. <ol> Per approssimazione di differenze di espressione, calcolare il rapporto della (SQ) valore di quantità di partenza ottenuto dal gene di prova (ad esempio, Diptericin A) rispetto al valore SQ ottenuto dal gene di riferimento (ad esempio, rp49) per ciascun campione (calcolata come SQ – DPTA / SQ – rp49). Scala questi rapporti ad un trattamento di controllo di base, come un controllo di gestione non infetto. Arbitrariamente impostare il livello di espressione di controllo pari a 1,0 e visualizzare trattamenti sperimentali come cambiamenti volte rispetto. Stimare il valore di SQ per ogni gene contro una curva standard generata da una serie di diluizioni di nota-quantità cDNA. NOTA: L'analisi statistica dei rapporti può essere complicato, per cui questo approccio è meglio per approssimazione rapido che per un'analisi rigorosa. Se l'efficienza della PCR è bassa, di progettare nuovi primer per migliorare la cinetica PCR, se possibile. Per le reazioni qPCR con quasi perfetta efficienza (adoubling del prodotto di PCR ogni ciclo), il ciclo di soglia (C T) può essere sostituito per il valore SQ. Per gli esperimenti semplici con amplificazione ottimale efficiente, i dati possono essere analizzati utilizzando il metodo ΔΔC T. 19 Per ogni campione, sottrarre il valore C T del gene di riferimento (ad esempio, rp49) dalla C T del gene prova (per esempio., Diptericin A) fino ad ottenere una ΔC T. Poi sottrarre la ΔC T del controllo di base dalla ΔC T per ciascun campione sperimentale per produrre un valore ΔΔC T per ogni campione; questo ΔΔC T è indicativa di relativi differenze nei livelli di espressione genica tra i trattamenti, dove 2 (-ΔΔCT) approssima la variazione piega espressione. NOTA: Questa analisi può gravemente misestimate ribaltabile cambiamento nell'espressione del gene bersaglio se la PCR sia del gene test o il riferimentogene ha una bassa efficienza. Per l'analisi più rigorosa, condurre analisi della varianza (ANOVA) utilizzando l'espressione stimato del gene prova (per esempio Diptericin A) come variabile di risposta e l'espressione stimata del gene di controllo (ad esempio rp49) e altri fattori sperimentali come variabili esplicative. NOTA: Questo approccio è relativamente robusta di inefficienza in PCR e consente l'analisi di disegni sperimentali più complicate.