ניתוח ההשפעות של תאי סטרומה על הגיוס של לויקוציטים מתזרים
Summary
היכולת של האנדותל מודלק לגייס leukocytes מזרימה מוסדרת על ידי תאי סטרומה mesenchymal. אנו מתארים שני מודלים במבחנה בשילוב תאים אנושיים עיקריים שיכול לשמש כדי להעריך גיוס נויטרופילים מזרימה ולבחון את התפקיד שתאי סטרומה mesenchymal לשחק בויסות התהליך הזה.
Abstract
תאי סטרומה להסדיר את הגיוס במחזור leukocytes במהלך דלקת דרך הצטלבות עם תאי האנדותל שכנים. כאן אנו מתארים שני מודלים במבחנה "כלי דם" ללימוד הגיוס של מחזורי נויטרופילים מזרימה על ידי תאי האנדותל מודלקים. יתרון עיקרי של מודלים אלה הוא היכולת לנתח כל צעד במפל ההידבקות לויקוציטים במטרה, כפי שהיה קורה בvivo. אנו גם מתארים כיצד ניתן להתאים את שני המודלים כדי ללמוד את התפקיד של תאי סטרומה, בתאי גזע mesenchymal זה מקרה (MSC), בויסות גיוס לויקוציטים.
תאי האנדותל עיקריים היו בתרבית לבד או יחד עם MSC אדם במגע ישיר על microslides Ibidi או בצדדים מנוגדים של מסנן Transwell למשך 24 שעות. תרבויות היו מגורה עם אלפא גורם נמק גידול (TNFα) למשך 4 שעות ושולבו assay הידבקות מבוסס זרימה. בולוס של נויטרופילים היה perfusedעל האנדותל למשך 4 דקות. לכידתו של זורם נויטרופילים ויחסי הגומלין שלהם עם האנדותל הייתה דמיינה ידי מיקרוסקופ שלב ניגודיות.
בשני המודלים, ציטוקינים גירוי מוגבר גיוס האנדותל של נויטרופילים זורמים באופן תלוי מינון. ניתוח של ההתנהגות של נויטרופילים גויסו הראה ירידה תלויה-מינון בגלגול ועלייה תלוי-מינון בגלגול דרך האנדותל. בשיתוף התרבות, MSC מודחק הידבקות נויטרופילים להאנדותל מגורה TNFα.
המודלים המבוססת על הידבקות הזרימה שלנו לחקות את השלבים הראשונים של גיוס לויקוציטים מהמחזור. בנוסף לויקוציטים, הם יכולים לשמש כדי לבחון את הגיוס של סוגי תאים אחרים, כגון תאים סרטניים MSC או מחזור מנוהלים טיפולי. דגמי שיתוף התרבות רב-שכבתי שלנו הראו כי MSC לתקשר עם האנדותל לשנות את תגובתם לציטוקינים פרו-דלקתיים, altering הגיוס של נויטרופילים. מחקר נוסף תוך שימוש במודלים אלה נדרש כדי להבין איך תאי סטרומה מרקמות שונות ותנאים (מחלות דלקתיות או סרטן) להשפיע על הגיוס של לויקוציטים במהלך דלקת.
Introduction
דלקת היא תגובה הגנתית לזיהום חיידקים או פגיעה ברקמות שדורשת רגולציה הדוקה של כניסה לויקוציטים וליציאה מהרקמה הדלקתית לאפשר 1,2 רזולוציה. צלב-שיחה בין תאי האנדותל (EC) שכלי דם קו, כדוריות דם לבנות במחזור ותאי סטרומה רקמות תושב חיונית לתיאום תהליך זה 3. עם זאת, גיוס בלתי מבוקר של כדוריות דם לבנות והפינוי יעיל שלהם לחזק את התפתחותן של מחלות דלקתיות כרוניות 4. ההבנה הנוכחית שלנו של גיוס לויקוציטים בבריאות ובמחלה אינה שלמה ויש צורך במודלים חזקים יותר כדי לנתח את התהליך הזה.
המנגנונים התומכים בגיוס של לויקוציטים מהדם דרך כלי דם בEC venules פוסט-נימים תוארו גם 1,2,5. כדוריות דם לבנות במחזור נלכדים על ידי קולטנים מיוחדים (למשל, VCAM-1, E-selectin, P-selectin) שהם מוסדרים על האנדותל מודלק. אינטראקציות חולפות אלה מאפשרים לויקוציטים לאינטראקציה עם כמוקינים משטח מחויב ומתווכים הנגזרים שומנים (או אנדותל או סטרומה במקור) המפעילים integrins לידי ביטוי על ידי כדוריות דם לבנות 6 11. זה בתורו מייצב הגירת הידבקות וכוננים על פני האנדותל ולתוך הרקמה 12 15. בתוך רקמה, גויס לויקוציטים נתונים לסוכנים הנגזר סטרומה המשפיעים על תנועתיות, תפקוד והישרדות 16,17. ראיות הולכות ומצטברים מצביעות בבירור על אותות המתקבלים בכל שלב של לויקוציטים תנאי תהליך הגיוס למשנו. עם זאת, ההבנה של גיוס לויקוציטים שלנו נשארת שלמה ומעט מאוד ידוע על תנועת ויקוציטים עיצוב רכיבים בתוך רקמה.
בברמינגהם פיתחנו כמה מודלים "כלי דם" מבחנה ללמוד הגיוס של לויקוציטים מלזרום 9,18,19. עכשיו אנו מבינים כי רגולטורים מיידיים כמעשה EC כלי דם של גיוס לויקוציטים בתגובה לשינויים במייקרו-הסביבה המקומית שלהם. באופן ספציפי, תאי סטרומה רקמה-תושב יכולים להסדיר באופן פעיל את התגובה הדלקתית, בחלקו על ידי שיחה עם EC כלי הדם השכן להשפיע תפקידם בגיוס 3. הראינו בעבר כי תאי סטרומה שונים לווסת את היכולת של EC לתמוך הידבקות והגירה של לויקוציטים באופן רקמות ספציפיות, וכי ההשפעות אלה הופכים שינו במחלות כרוניות 13,16,20,21. כך, תאי סטרומה להקים רקמה 'כתובת קודים "המגדירים את ההקשר של כל תגובה דלקתית 22. לאחרונה, יש לנו הפגנו שMSC מח עצם נגזר (BMMSC) מטה-להסדיר בעצמת התגובה של EC לציטוקינים, שהביא לירידה בגיוס של שני נויטרופילים וימפוציטים 23.
מנגנוני גובגיוס erning הובהר במבחנה השתמש בעיקר מבחני שילוב סוג תא בודד (למשל, EC) או חלבון בבידוד. עם זאת, מחקרים אלה לא לוקחים בחשבון את ההשפעות של סביבת הרקמות המקומית (כלומר, הנוכחות של תאי סטרומה) על גיוס של לויקוציטים וההגירה הבאה שלהם לתוך הרקמה. כאן אנו מתארים שתי שיטות המבוססת על זרימה שבו תאי סטרומה, במיוחד mesenchymal תאי גזע (MSC), הם שיתוף תרבותי עם EC 23. מודלים כאלה מאפשרים לנו לבחון את ההשפעה של תא סטרומה על תגובות אנדותל, ביכולת שלהם בפרט לתמוך גיוס לויקוציטים מזרימה.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן אנו מתארים שני מודלים במבחנה "כלי דם" ללימוד הגיוס של מחזורי נויטרופילים ידי האנדותל מודלק. יתרון עיקרי של מודלים אלה הוא היכולת לנתח כל צעד במפל ההידבקות לויקוציטים במטרה, כפי שהיה קורה בvivo. יש לנו שנצפה קודם לכן עלייה תלויה-מינון בהידבקות נויטרופ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Umbilical cords were collected with the assistance of the Birmingham Women’s Health Care NHS Trust. HMM was supported by an Arthritis Research UK Career Development Fellowship (19899) and Systems Science for Health, University of Birmingham (5212).
Materials
| Collagenase Type Ia | Sigma | C2674 | Dilute in 10ml PBS to get a final concentration of 10mg/ml. Store at -20°C in 1ml aliquots. |
| Dulbecco's PBS | Sigma | D8662 | With calcium and magnesium chloride. Keep sterile and store at room temperature. |
| 1X Medium M199 | Gibco | 31150-022 | Warm in 37 °C water bath before use. |
| Gentamicin sulphate | Sigma | G1397 | Store at 4°C. Add to M199 500ml bottle. |
| Human epidermal growth factor | Sigma | E9644 | Store at -20°C in 10µl aliquots. |
| Fetal calf serum (FCS) | Sigma | F9665 | FCS must be batch tested to ensure the growth and viability of isolated EC. Heat inactivate at 56°C. Store in 10ml aliquots at -20°C. |
| Amphotericin B | Gibco | 15290-026 | Potent and becomes toxic within a week so fresh complete HUVEC medium must be made up every week. Store at -20°C in 1ml aliquots. |
| Hydrocortisone | Sigma | H0135 | Stock is in ethanol. Store at -20°C in 10µl aliquots. |
| Collagenase Type II | Sigma | C6885 | Dilute stock in PBS to a final concentration of 100mg/ml. Store at -20°C in 100µl aliquots. |
| Hyaluronidase | Sigma | H3631 | Dilute stock in PBS to a final concentration of 20,000U/ml. Store at -20°C in 100µl aliquots. |
| 100µm cell strainer for 50ml centifuge tube | Scientific Lab Supplies (SLS) | 352360 | Other commercially available cell strainers (e.g. Greiner bio-one) can also be used. |
| DMEM low glucose | Biosera | LM-D1102/500 | Warm in 37 °C water bath before use. |
| Penicillin/Streptomycin mix | Sigma | P4333 | Store at -20°C in 1ml aliquots. |
| 25cm2 tissue culture flask | SLS | 353109 | |
| 75cm2 tissue culture flask | SLS | 353136 | |
| Bone marrow mesenchymal stem cells vial | Lonza | PT-2501 | Store in liquid nitrogen upon arrival. Cells are at passage 2 upon arrival but are designated passage 0. Exapand to passage 3 and store in liquid nitrogen for later use. |
| Mesenchymal stem cell growth medium (MSCGM) | Lonza | PT-3001 | Warm in 37 °C water bath before use. For Cell Tracker Green staining use medium without FCS. |
| EDTA (0.02%) solution | Sigma | E8008 | Store at 4°C. Warm in 37°C water bath before use. |
| Trypsin solution | Sigma | T4424 | Store at -20°C in 2ml aliquots. Thaw at room temperature and use immediately. |
| Cryovials | Greiner bio-one | 2019-02 | Keep on ice before adding before adding cell suspension. |
| Mr. Frosty Freezing Container | Nalgene | 5100-0001 | Store at room temperature. When adding cryovials with cells store at -80°C for 24h before transfrring cells to liquid nitrogen. |
| Ibidi u-Slide VI (0.4), T/C treated, sterile | Ibidi | IB-80606 | Alternative models include glass capillaries, Cellix Biochips (www.cellixltd.com), BioFlux Plates (www.fluxionbio.com/bioflux/) and GlycoTech parallel plate flow chambers (http://www.glycotech.com/apparatus/parallel.html). |
| Cell tracker green dye | Life technologies | C2925 | Store in 5µl aliquots at -20°C. Dilute in 5ml prewarmed (at 37°C) MSCGM. |
| Cell counting chambers | Nexcelom | SD-100 | Alternatively a haemocytometer can be used. |
| Cellometer auto T4 cell counter | Nexcelom | Auto T4-203-0238 | |
| Tumor necrosis factor α (TNFα) | R&D Systems | 210-TA-100 | Dilute stock in PBS to a final concentration of 100,000U/ml. Store at -80°C in 10µl aliquots. |
| 6-well, 0.4µm PET Transwell filters | SLS | 353090 | |
| K2-EDTA in 10ml tubes | Sarstedt | Store at room temperature. | |
| Histopaque 1119 | Sigma | 11191 | Store at 4°C. Warm to room temperature before use. |
| Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | Store at 4°C. Warm to room temperature before use. |
| 10ml round bottomed tube | Appleton Woods | SC211 142 AS | |
| 7.5% BSA Fraction V solution | Life technologies | 15260-037 | Store at 4°C. |
| 20ml Plastipak syringes | BD falcon | 300613 | |
| 5ml Plastipak syringes | BD falcon | 302187 | |
| 2ml Plastipak syringes | BD falcon | 300185 | |
| 3M hypo-allergenic surgical tape 9m x 2.5cm | Micropore | 1530-1 | Use to secure the syringe tap onto the wall of the perspex chamber. |
| Silicon rubber tubing, internal diameter/external diameter (ID/OD) of 1/3mm (thin tubing) | Fisher Scientific | FB68854 | Cut silicon tubing to the appropriate size. All tubing leading directly to the electronic microvalve must be thin. |
| Silicon rubber tubing ID/OD of 2/4mm (thick tubing) | Fisher Scientific | FB68855 | |
| Portex Blue Line Manometer tubing | Smiths | 200/495/200 | Tubing leading to the syringe pump. |
| 3-way stopcock | BOC Ohmeda AB | ||
| Glass 50ml syringe for pump | Popper Micromate | 550962 | Must be primed prior to use by removing any air bubbles. |
| Glass coverslip | Raymond A Lamb | 26x76mm coverslips made to order. Lot number 2440980. | |
| Parafilm gasket | American National Can Company | Cut a 26x76mm piece of parafilm using an aluminium template and cut a 20x4mm slot into it using a scalpel 10a. Gasket thickness is approximately 133µm. | |
| Two perspex parallel plates | Wolfson Applied Technology Laboratory | Specially designed chamber consisting of parallel plates held together by 8 screws. The lower plate has a viewing slot cut out in the middle and a shallow recess milled to allow space for the coverslip, filter and gasket. The upper perspex plate has an inlet and outlet hole positioned over the flow channel. | |
| Electronic 3-way microvalve with min. dead space | Lee Products Ltd. | LFYA1226032H | Electronically connected to a 12 volt DC power supply. |
| Syringe pump for infusion/withdrawal (PHD2000) | Harvard Apparatus | 70-2001 | Set the diameter to 29mm and refill (flow) rate. |
| L-shaped connector | Labhut | LE876 | To attach to the inlet and outlet ports onto the Ibidi microslide channel. |
| Video camera | Qimaging | 01-QIC-F-M-12-C | Connected to a computer which enables digitall videos to be recorded. |
| Image-Pro Plus 7.0 | Media Cybernetics | 41N70000-61592 | For data analysis. Manually tag cells displaying the different behaviors. Track cells for analysis of rolling and migration velocities. |
| Refer to product datasheets for details on hazards of using the reagents described here. |
References
- Springer, T. A. Traffic signals on endothelium for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration. Ann. Rev. Physiol. 57, 827-872 (1995).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature reviews. Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
- McGettrick, H. M., Butler, L. M., Buckley, C. D., Rainger, G. E., Nash, G. B. Tissue stroma as a regulator of leukocyte recruitment in inflammation. Journal of leukocyte biology. 91 (3), 385-400 (2012).
- Serhan, C. N., Savill, J. Resolution of inflammation: the beginning programs the end. Nature immunology. 6 (12), 1191-1197 (2005).
- Schmidt, S., Moser, M., Sperandio, M. The molecular basis of leukocyte recruitment and its deficiencies. Molecular immunology. 55, 49-58 (2013).
- Luu, N. T., Rainger, G. E., Nash, G. B. Differential Ability of Exogenous Chemotactic Agents to Disrupt Transendothelial Migration of Flowing Neutrophils. The Journal of Immunology. 164 (11), 5961-5969 (2000).
- Smith, C. W., Rothlein, R., et al. Recognition of an endothelial determinant for CD 18-dependent human neutrophil adherence and transendothelial migration. The Journal of clinical investigation. 82 (5), 1745-1756 (1988).
- Luscinskas, F. W., Brock, A. F., Arnaout, M. A., Gimbrone, M. A. Endothelial-leukocyte adhesion molecule-1-dependent and leukocyte (CD11/CD18)-dependent mechanisms contribute to polymorphonuclear leukocyte adhesion to cytokine-activated human vascular endothelium. J. Immunol. 142 (7), (1989).
- Bahra, P., Rainger, G. E., Wautier, J. L., Nguyet-Thin, L., Nash, G. B. Each step during transendothelial migration of flowing neutrophils is regulated by the stimulatory concentration of tumour necrosis factor-alpha. Cell adhesion and communication. 6 (6), 491-501 (1998).
- Piali, L., Weber, C., et al. The chemokine receptor CXCR3 mediates rapid and shear-resistant adhesion-induction of effector T lymphocytes by the chemokines IP10 and Mig. European journal of immunology. 28 (3), 961-972 (1998).
- McGettrick, H. M., Smith, E., et al. Fibroblasts from different sites may promote or inhibit recruitment of flowing lymphocytes by endothelial cells. European journal of immunology. 39 (1), 113-125 (2009).
- McGettrick, H. M., Hunter, K., Moss, P. a., Buckley, C. D., Rainger, G. E., Nash, G. B. Direct observations of the kinetics of migrating T cells suggest active retention by endothelial cells with continual bidirectional migration. Journal of leukocyte biology. 85 (1), 98-107 (2009).
- McGettrick, H. M., Buckley, C. D., Filer, A., Rainger, G. E., Nash, G. B. Stromal cells differentially regulate neutrophil and lymphocyte recruitment through the endothelium. Immunology. 131 (3), 357-370 (2010).
- Tull, S. P., Yates, C. M., et al. Omega-3 Fatty acids and inflammation: novel interactions reveal a new step in neutrophil recruitment. PLoS biology. 7 (8), e1000177 (2009).
- Ahmed, S. R., McGettrick, H. M. Prostaglandin D2 regulates CD4+ memory T cell trafficking across blood vascular endothelium and primes these cells for clearance across lymphatic endothelium. Journal of immunology. 187 (3), 1432-1439 (2011).
- Bradfield, P. F., Amft, N., et al. Rheumatoid fibroblast-like synoviocytes overexpress the chemokine stromal cell-derived factor 1 (CXCL12), which supports distinct patterns and rates of CD4+ and CD8+ T cell migration within synovial tissue. Arthritis and rheumatism. 48 (9), 2472-2482 (2003).
- Filer, A., Parsonage, G., et al. Differential survival of leukocyte subsets mediated by synovial, bone marrow, and skin fibroblasts: site-specific versus activation-dependent survival of T cells and neutrophils. Arthritis and rheumatism. 54 (7), 2096-2108 (2006).
- Lally, F., Smith, E., et al. A novel mechanism of neutrophil recruitment in a coculture model of the rheumatoid synovium. Arthritis and rheumatism. 52 (11), 3460-3490 (2005).
- Chakravorty, S. J., McGettrick, H. M., Butler, L. M., Buckley, C. D., Rainger, G. E., Nash, G. B. An in vitro. model for analysing neutrophil migration into and away from the sub-endothelial space: Roles of flow and CD31. Biorheology. 43 (1), 71-82 (2006).
- Rainger, G. E., Nash, G. B. Cellular Pathology of Atherosclerosis Smooth Muscle Cells Prime Cocultured Endothelial Cells for Enhanced Leukocyte Adhesion. Circulation Research. 88 (6), 615-622 (2001).
- Kuravi, S. J., McGettrick, H. M. Podocytes regulate neutrophil recruitment by glomerular endothelial cells via IL-6-mediated crosstalk. Journal of immunology. 193 (1), 234-243 (2004).
- Parsonage, G., Filer, A. D. A stromal address code defined by fibroblasts. Trends in immunology. 26 (3), 150-156 (2005).
- Luu, N. T., McGettrick, H. M. Crosstalk between mesenchymal stem cells and endothelial cells leads to downregulation of cytokine-induced leukocyte recruitment. Stem cells. 31 (12), 2690-2702 (2013).
- Bevilacqua, M. P., Nelson, R. M., Mannori, G., Cecconi, O. Endothelial-leukocyte adhesion molecules in human disease. Annual review of medicine. 45, 361-378 (1994).
- Stanness, K. A., Beatty, P. G., Ochs, H. D., Harlan, J. M. An endothelial cell surface factor(s) induced in vitro. 136 (12), 4548-4553 (1986).
- Burton, V. J., Butler, L. M. Delay of migrating leukocytes by the basement membrane deposited by endothelial cells in long-term culture. Experimental cell research. 317 (3), 276-292 (2011).
- Luu, N. T., Rainger, G. E., Buckley, C. D., Nash, G. B. CD31 Regulates Direction and Rate of Neutrophil Migration over and under Endothelial Cells. Journal of Vascular Research. 40 (5), 467-479 (2003).
- McGettrick, H. M., Buckley, C. D., Ed Rainger, G., Nash, G. B. Influence of stromal cells on lymphocyte adhesion and migration on endothelial cells. Methods in molecular biology. 616, 49-68 (2010).
- Butler, L. M., McGettrick, H. M., Nash, G. B. Static and dynamic assays of cell adhesion relevant to the vasculature. Methods in molecular biology. 467, 211-228 (2009).
- Jeffery, H. C., Buckley, C. D., Moss, P., Rainger, G. E., Nash, G. B., McGettrick, H. M. Analysis of the effects of stromal cells on the migration of lymphocytes into and through inflamed tissue using 3-D culture models. Journal of immunological methods. 400-401, 45-57 (2013).
