Analyse der Auswirkungen von Stromazellen an der Rekrutierung von Leukozyten von Flow
Summary
Die Fähigkeit von entzündetem Endothel Leukozyten aus Strömungs Rekrutierung von mesenchymalen Stromazellen geregelt. Wir beschreiben zwei in vitro Modelle mit primären humanen Zellen, die verwendet werden können, um neutrophilen Rekrutierung von Flow zu bewerten und zu prüfen, welche Rolle die mesenchymalen Stromazellen bei der Regulierung dieses Prozesses spielen.
Abstract
Stromazellen wird über die Einstellung der zirkulierenden Leukozyten bei Entzündungen durch Übersprechen mit benachbarten Endothelzellen. Hier beschreiben wir zwei in vitro "vaskuläre" Modelle für die Untersuchung der Rekrutierung von zirkulierenden Neutrophilen von Flow von entzündeten Endothelzellen. Ein wesentlicher Vorteil dieser Modelle ist die Fähigkeit, jeden Schritt in der Leukozytenadhäsion Kaskade zu analysieren, wie es in vivo auftreten. Wir beschreiben auch, wie die beiden Modelle angepasst werden, um die Rolle von Stromazellen, in diesem Fall von mesenchymalen Stammzellen (MSC) zu untersuchen, bei der Regulierung der Leukozytenrekrutierung werden.
Primäre Endothelzellen wurden allein oder zusammen mit menschlicher MSC in direktem Kontakt auf Ibidi Mikroglaschen oder auf gegenüberliegenden Seiten eines Transwell-Filter für 24 h kultiviert. Die Kulturen wurden mit den Tumornekrosefaktor alpha (TNF & agr;) für 4 Stunden stimuliert und in eine flussbasierte Adhäsionsassay eingebaut. Bolus von Neutrophilen perfundiertüber das Endothel für 4 min. Die Erfassung des fließenden Neutrophilen und ihre Wechselwirkungen mit dem Endothel wurde durch Phasenkontrastmikroskopie visualisiert.
In beiden Modellen erhöhte Zytokin-Stimulation endothelialer Rekrutierung von Neutrophilen fließt in einer Dosis-abhängige Weise. Analyse des Verhaltens der rekrutierten Neutrophile zeigten eine dosisabhängige Abnahme der Walzen und eine Dosis-abhängige Zunahme der Transmigration durch das Endothel. Bei Co-Kultur, unterdrückt MSC neutrophile Adhäsion an TNF-stimulierte Endothelzellen.
Unsere flussbasierten Haftmodelle imitieren die ersten Phasen der Rekrutierung von Leukozyten aus dem Kreislauf. Neben Leukozyten, können sie verwendet werden, um die Einstellung von anderen Zelltypen, wie beispielsweise therapeutisch verabreicht MSC oder zirkulierenden Tumorzellen zu untersuchen. Unsere mehrschichtigen Co-Kulturmodelle haben gezeigt, dass MSC kommunizieren Endothel ihre Reaktion auf proinflammatorische Cytokine modifizieren altering die Rekrutierung von Neutrophilen. Weitere Untersuchungen mit Hilfe solcher Modelle ist erforderlich, um zu verstehen, wie Stromazellen aus verschiedenen Geweben und Bedingungen (entzündliche Erkrankungen oder Krebs) Einfluss auf die Rekrutierung von Leukozyten während der Entzündung.
Introduction
Die Entzündung ist eine schützende Immunantwort gegen mikrobielle Infektionen oder Gewebeverletzung, die strenge Regulierung von Leukozyten-Eingangs- und Ausgangs aus dem entzündeten Gewebe benötigt, um die Auflösung 1,2 erlauben. Übersprechen zwischen Endothelzellen (EC), dass Leitungsblutgefäße, zirkulierenden Leukozyten und gewebe Wohnsitz Stromazellen ist für die Koordinierung dieses Prozesses 3. , Unkontrollierte Rekrutierung von Leukozyten und deren unwirksam Freiheit zu untermauern jedoch die Entwicklung von chronischen Entzündungskrankheiten 4. Unser gegenwärtiges Verständnis der Rekrutierung von Leukozyten in Gesundheit und Krankheit ist unvollständig und robustere Modelle sind erforderlich, um diesen Prozess zu untersuchen.
Die Mechanismen, die die Unterstützung der Rekrutierung von Leukozyten aus Blut durch Gefäß EG in post Venolen sind gut beschrieben 1,2,5 worden. Zirkulierende Leukozyten werden von spezialisierten Rezeptoren (zB VCAM-1, E-Selektin, P-Selektin) erfasst dieauf entzündete Endothel hochreguliert. Diese transienten Interaktionen ermöglichen Leukozyten mit Oberfläche gebunden Chemokinen und Lipid abgeleiteten Mediatoren (entweder endothelialen oder Stroma Ursprungs), die Integrine durch Leukozyten 6- 11 ausgedrückt aktivieren interagieren. Dies wiederum stabilisiert die Haftung und Antriebe Migration über das Endothelium in das Gewebe 12 bis 15. Im Gewebe rekrutiert Leukozyten zu Stroma stammenden Mittel, die ihre Beweglichkeit, Funktion und das Überleben 16,17 beeinflussen unterzogen. Immer deutlicher, deutet stark darauf hin, dass die Signale in jeder Phase der Rekrutierung von Leukozyten Bedingungen für die nächste erhalten. Jedoch bleibt das Verständnis der Leukozytenrekrutierung unvollständig und sehr wenig über die Komponenten Formgebungs Leukozytenbewegung im Gewebe bekannt.
In Birmingham haben wir mehrere in vitro "vaskuläre" Modelle entwickelt, um die Rekrutierung von Leukozyten aus studierenfließen 9,18,19. Wir verstehen jetzt, dass Gefäß EG fungieren als unmittelbare Regulatoren der Rekrutierung von Leukozyten reagieren auf Veränderungen in ihrer lokalen Mikroumgebung. Insbesondere können gewebe Wohnsitz Stromazellen aktiv reguliert die Entzündungsreaktion, teilweise im Gespräch mit benachbarten Gefäß EG, ihre Rolle bei der Einstellung 3 beeinflussen. Wir haben zuvor gezeigt, dass verschiedene Stromazellen modulieren die Fähigkeit von EG-Adhäsion und Migration von Leukozyten in einer gewebespezifischen Art und Weise zu unterstützen, und dass diese Effekte sich veränderten chronischer Erkrankungen 13,16,20,21. So Stromazellen etablieren Gewebe "Adresse-Codes", die den Kontext der einzelnen Entzündungsreaktion 22 zu definieren. In letzter Zeit haben wir gezeigt, dass aus dem Knochenmark MSC (BMMSC) potent herunterregulieren die Reaktion der EG auf Zytokine, was zu einer Verringerung in der Rekrutierung von Neutrophilen und Lymphozyten beiden 23.
Die Mechanismen govErning Rekrutierung aufgeklärt in vitro-Assays wurden weitgehend verwendet, das eine Zelltyp (zB EG) oder Protein isoliert. Allerdings sind diese Studien nicht berücksichtigt die Auswirkungen der lokalen Gewebeumgebung (dh die Anwesenheit von Stromazellen) auf Rekrutierung von Leukozyten und deren anschließende Migration in das Gewebe. Hier beschreiben wir zwei flussbasierte Verfahren, bei denen Stromazellen, insbesondere mesenchymale Stammzellen (MSC), co-kultiviert, das mit EC 23. Solche Modelle ermöglichen es uns, die Wirkung von Stromazellen auf endothelialen Reaktionen, insbesondere ihre Fähigkeit zur Rekrutierung von Leukozyten aus Fluss unterstützen zu untersuchen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschreiben wir zwei in vitro "vaskuläre" Modelle für die Untersuchung der Rekrutierung von zirkulierenden Neutrophilen durch entzündete Endothel. Ein wesentlicher Vorteil dieser Modelle ist die Fähigkeit, jeden Schritt in der Leukozytenadhäsion Kaskade zu analysieren, wie es in vivo auftreten. Wir haben bereits festgestellt, eine Dosis-abhängige Zunahme der Neutrophilen-Adhäsion an und Transmigration durch TNF-stimulierte EC 9,29. Wir beschreiben auch, wie die beiden M…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Umbilical cords were collected with the assistance of the Birmingham Women’s Health Care NHS Trust. HMM was supported by an Arthritis Research UK Career Development Fellowship (19899) and Systems Science for Health, University of Birmingham (5212).
Materials
| Collagenase Type Ia | Sigma | C2674 | Dilute in 10ml PBS to get a final concentration of 10mg/ml. Store at -20°C in 1ml aliquots. |
| Dulbecco's PBS | Sigma | D8662 | With calcium and magnesium chloride. Keep sterile and store at room temperature. |
| 1X Medium M199 | Gibco | 31150-022 | Warm in 37 °C water bath before use. |
| Gentamicin sulphate | Sigma | G1397 | Store at 4°C. Add to M199 500ml bottle. |
| Human epidermal growth factor | Sigma | E9644 | Store at -20°C in 10µl aliquots. |
| Fetal calf serum (FCS) | Sigma | F9665 | FCS must be batch tested to ensure the growth and viability of isolated EC. Heat inactivate at 56°C. Store in 10ml aliquots at -20°C. |
| Amphotericin B | Gibco | 15290-026 | Potent and becomes toxic within a week so fresh complete HUVEC medium must be made up every week. Store at -20°C in 1ml aliquots. |
| Hydrocortisone | Sigma | H0135 | Stock is in ethanol. Store at -20°C in 10µl aliquots. |
| Collagenase Type II | Sigma | C6885 | Dilute stock in PBS to a final concentration of 100mg/ml. Store at -20°C in 100µl aliquots. |
| Hyaluronidase | Sigma | H3631 | Dilute stock in PBS to a final concentration of 20,000U/ml. Store at -20°C in 100µl aliquots. |
| 100µm cell strainer for 50ml centifuge tube | Scientific Lab Supplies (SLS) | 352360 | Other commercially available cell strainers (e.g. Greiner bio-one) can also be used. |
| DMEM low glucose | Biosera | LM-D1102/500 | Warm in 37 °C water bath before use. |
| Penicillin/Streptomycin mix | Sigma | P4333 | Store at -20°C in 1ml aliquots. |
| 25cm2 tissue culture flask | SLS | 353109 | |
| 75cm2 tissue culture flask | SLS | 353136 | |
| Bone marrow mesenchymal stem cells vial | Lonza | PT-2501 | Store in liquid nitrogen upon arrival. Cells are at passage 2 upon arrival but are designated passage 0. Exapand to passage 3 and store in liquid nitrogen for later use. |
| Mesenchymal stem cell growth medium (MSCGM) | Lonza | PT-3001 | Warm in 37 °C water bath before use. For Cell Tracker Green staining use medium without FCS. |
| EDTA (0.02%) solution | Sigma | E8008 | Store at 4°C. Warm in 37°C water bath before use. |
| Trypsin solution | Sigma | T4424 | Store at -20°C in 2ml aliquots. Thaw at room temperature and use immediately. |
| Cryovials | Greiner bio-one | 2019-02 | Keep on ice before adding before adding cell suspension. |
| Mr. Frosty Freezing Container | Nalgene | 5100-0001 | Store at room temperature. When adding cryovials with cells store at -80°C for 24h before transfrring cells to liquid nitrogen. |
| Ibidi u-Slide VI (0.4), T/C treated, sterile | Ibidi | IB-80606 | Alternative models include glass capillaries, Cellix Biochips (www.cellixltd.com), BioFlux Plates (www.fluxionbio.com/bioflux/) and GlycoTech parallel plate flow chambers (http://www.glycotech.com/apparatus/parallel.html). |
| Cell tracker green dye | Life technologies | C2925 | Store in 5µl aliquots at -20°C. Dilute in 5ml prewarmed (at 37°C) MSCGM. |
| Cell counting chambers | Nexcelom | SD-100 | Alternatively a haemocytometer can be used. |
| Cellometer auto T4 cell counter | Nexcelom | Auto T4-203-0238 | |
| Tumor necrosis factor α (TNFα) | R&D Systems | 210-TA-100 | Dilute stock in PBS to a final concentration of 100,000U/ml. Store at -80°C in 10µl aliquots. |
| 6-well, 0.4µm PET Transwell filters | SLS | 353090 | |
| K2-EDTA in 10ml tubes | Sarstedt | Store at room temperature. | |
| Histopaque 1119 | Sigma | 11191 | Store at 4°C. Warm to room temperature before use. |
| Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | Store at 4°C. Warm to room temperature before use. |
| 10ml round bottomed tube | Appleton Woods | SC211 142 AS | |
| 7.5% BSA Fraction V solution | Life technologies | 15260-037 | Store at 4°C. |
| 20ml Plastipak syringes | BD falcon | 300613 | |
| 5ml Plastipak syringes | BD falcon | 302187 | |
| 2ml Plastipak syringes | BD falcon | 300185 | |
| 3M hypo-allergenic surgical tape 9m x 2.5cm | Micropore | 1530-1 | Use to secure the syringe tap onto the wall of the perspex chamber. |
| Silicon rubber tubing, internal diameter/external diameter (ID/OD) of 1/3mm (thin tubing) | Fisher Scientific | FB68854 | Cut silicon tubing to the appropriate size. All tubing leading directly to the electronic microvalve must be thin. |
| Silicon rubber tubing ID/OD of 2/4mm (thick tubing) | Fisher Scientific | FB68855 | |
| Portex Blue Line Manometer tubing | Smiths | 200/495/200 | Tubing leading to the syringe pump. |
| 3-way stopcock | BOC Ohmeda AB | ||
| Glass 50ml syringe for pump | Popper Micromate | 550962 | Must be primed prior to use by removing any air bubbles. |
| Glass coverslip | Raymond A Lamb | 26x76mm coverslips made to order. Lot number 2440980. | |
| Parafilm gasket | American National Can Company | Cut a 26x76mm piece of parafilm using an aluminium template and cut a 20x4mm slot into it using a scalpel 10a. Gasket thickness is approximately 133µm. | |
| Two perspex parallel plates | Wolfson Applied Technology Laboratory | Specially designed chamber consisting of parallel plates held together by 8 screws. The lower plate has a viewing slot cut out in the middle and a shallow recess milled to allow space for the coverslip, filter and gasket. The upper perspex plate has an inlet and outlet hole positioned over the flow channel. | |
| Electronic 3-way microvalve with min. dead space | Lee Products Ltd. | LFYA1226032H | Electronically connected to a 12 volt DC power supply. |
| Syringe pump for infusion/withdrawal (PHD2000) | Harvard Apparatus | 70-2001 | Set the diameter to 29mm and refill (flow) rate. |
| L-shaped connector | Labhut | LE876 | To attach to the inlet and outlet ports onto the Ibidi microslide channel. |
| Video camera | Qimaging | 01-QIC-F-M-12-C | Connected to a computer which enables digitall videos to be recorded. |
| Image-Pro Plus 7.0 | Media Cybernetics | 41N70000-61592 | For data analysis. Manually tag cells displaying the different behaviors. Track cells for analysis of rolling and migration velocities. |
| Refer to product datasheets for details on hazards of using the reagents described here. |
References
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