Het analyseren van de effecten van stromale cellen op de recrutering van leukocyten van Flow
Summary
Het vermogen van ontstoken endotheel om leukocyten werven van stroom wordt geregeld door mesenchymale stromale cellen. We beschrijven twee in vitro modellen die primaire humane cellen die kunnen worden gebruikt om neutrofielen werving beoordelen van stroom en onderzoekt de rol van mesenchymale stromale cellen spelen in het reguleren van dit proces.
Abstract
Stromale cellen regelen de werving van circulerende leukocyten tijdens ontsteking door middel van cross-talk met naburige endotheelcellen. Hier beschrijven we twee in vitro "vasculaire" modellen voor het bestuderen van de werving van circulerende neutrofielen uit stroom door ontstoken endotheelcellen. Een groot voordeel van deze modellen is de mogelijkheid om elke stap in de leukocyt adhesie cascade analyseren om, zoals zou optreden in vivo. We beschrijven ook hoe beide modellen kunnen worden aangepast om de rol van stromale cellen, in dit geval mesenchymale stamcellen (MSC) bestuderen reguleren rekrutering van leukocyten.
Primaire endotheelcellen werden alleen of tezamen gekweekt met menselijke MSC in direct contact IBIDI microslides of aan weerszijden van een Transwell filter gedurende 24 uur. De kweken werden gestimuleerd met tumornecrosefactor alfa (TNFa) gedurende 4 uur en opgenomen in een stroomgebaseerde adhesietest. Een bolus van neutrofielen werd geperfuseerdvia endotheel gedurende 4 min. De vangst van stromende neutrofielen en hun interacties met het endothelium werd gevisualiseerd door fase contrast microscopie.
In beide modellen, cytokine-stimulatie verhoogde endotheliale rekrutering van neutrofielen stroomt op een dosis-afhankelijke wijze. Analyse van het gedrag gerekruteerde neutrofielen vertoonden een dosisafhankelijke afname walsen en een dosisafhankelijke toename transmigratie door het endotheel. In co-cultuur MSC onderdrukt neutrofiel adhesie aan TNFa-gestimuleerd endotheel.
Onze flow-based-adhesie-modellen na te bootsen de eerste fasen van rekrutering van leukocyten uit de circulatie. Naast leukocyten, kunnen zij worden gebruikt om de rekrutering van andere celtypen, zoals therapeutisch toegediend MSC of circulerende tumorcellen onderzocht. De meerlagige co-cultuur modellen hebben aangetoond dat MSC communiceren met endotheel hun respons op pro-inflammatoire cytokines te wijzigen, Altering de rekrutering van neutrofielen. Verder onderzoek met behulp van dergelijke modellen is nodig om volledig te begrijpen hoe stromale cellen uit verschillende weefsels en voorwaarden (inflammatoire aandoeningen of kanker) invloed hebben op de werving van leukocyten tijdens ontsteking.
Introduction
Ontsteking is een beschermende reactie op microbiële infectie of weefselschade dat strakke regulering van leukocyten binnenkomst in en vertrek uit het ontstoken weefsel vereist om de resolutie 1,2 toe te staan. Cross-talk tussen de endotheelcellen (EC) die lijn bloedvaten, circulerende leukocyten en weefsel-resident stromale cellen is essentieel voor de coördinatie van dit proces 3. Echter, ongecontroleerde werving van leukocyten en hun ineffectieve klaring ondersteuning van de ontwikkeling van chronische ontstekingsziekten 4. Ons huidige begrip van leukocyt rekrutering in gezondheid en ziekte onvolledig en robuuster modellen zijn nodig om dit te analyseren.
De mechanismen ter ondersteuning van de werving van leukocyten uit het bloed door vasculaire EG in post-capillaire venulen zijn goed beschreven 1,2,5. Circulerende leukocyten worden opgevangen door gespecialiseerde receptoren (bijvoorbeeld, VCAM-1, E-selectine, P-selectine), datzijn up-gereguleerd op ontstoken endotheel. Deze voorbijgaande interacties laten leukocyten te interageren met het oppervlak gebonden chemokinen en lipide-afgeleide mediatoren (hetzij endotheliale of stromale oorsprong) die integrinen van leukocyten 6- 11 expressie activeren. Dit op zijn beurt stabiliseert hechting en drives migratie over het endotheel en in het weefsel 12- 15. Binnen weefsel, aangeworven leukocyten worden onderworpen aan stroma afgeleide middelen die hun beweeglijkheid, functie en overleving 16,17 beïnvloeden. Steeds meer bewijs suggereert sterk dat signalen ontvangen in elke fase van het wervingsproces voorwaarden leukocyten voor de volgende. Echter, ons begrip van leukocytaantrekking blijft onvolledig en is zeer weinig bekend over de componenten vormgeven leukocyten verkeer binnen weefsel.
In Birmingham hebben we verschillende in vitro "vasculaire" modellen ontwikkeld om de rekrutering van leukocyten bestuderen vanstromen 9,18,19. We begrijpen nu dat vasculaire EG-besluit als onmiddellijke regulatoren van leukocytaantrekking reageren op veranderingen in hun lokale micro-omgeving. Specifiek kan weefsel-resident stromale cellen actief reguleren van de ontstekingsreactie, voor een deel door het converseren met naburige vasculaire EG om hun rol te beïnvloeden bij de werving 3. We hebben eerder aangetoond dat verschillende stromale cellen moduleren het vermogen van EG adhesie en migratie van leukocyten ondersteunen in een weefsel-specifieke wijze, en dat deze effecten worden veranderd in chronische ziekten 13,16,20,21. Zo stromale cellen vast weefsel 'adres-codes' die de context van elke ontstekingsreactie 22 definiëren. Onlangs hebben we aangetoond dat beenmerg afgeleide MSC (BMMSC) krachtig neerwaarts reguleren van de respons van EG cytokines, wat een verlaging van het werven van neutrofielen en lymfocyten 23.
De mechanismen govinrichtende recruitment toegelicht in vitro zijn grotendeels gebruikt assays opnemen van een enkele cel type (bijvoorbeeld, EG) of eiwit in isolement. Echter, deze studies geen rekening met de effecten van de lokale weefsel omgeving (dwz de aanwezigheid van stromale cellen) over de recrutering van leukocyten en de daaropvolgende migratie in het weefsel. Hier beschrijven we twee stroomgebaseerde werkwijzen waarbij stromale cellen, mesenchymale stamcellen (MSC), samen worden gekweekt met EC 23. Dergelijke modellen kunnen we het effect van de stromale cellen op endotheliale reacties, in het bijzonder hun vermogen om leukocytaantrekking ondersteunen van stroom te onderzoeken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschrijven we twee in vitro "vasculaire" modellen voor het bestuderen van de werving van circulerende neutrofielen door ontstoken endotheel. Een groot voordeel van deze modellen is de mogelijkheid om elke stap in de leukocyt adhesie cascade analyseren om, zoals zou optreden in vivo. We hebben eerder waargenomen dosis-afhankelijke toename van neutrofielen hechting aan en transmigratie door TNFa-gestimuleerde EC 9,29. We beschrijven ook hoe beide modellen kunnen worden aangepas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Umbilical cords were collected with the assistance of the Birmingham Women’s Health Care NHS Trust. HMM was supported by an Arthritis Research UK Career Development Fellowship (19899) and Systems Science for Health, University of Birmingham (5212).
Materials
| Collagenase Type Ia | Sigma | C2674 | Dilute in 10ml PBS to get a final concentration of 10mg/ml. Store at -20°C in 1ml aliquots. |
| Dulbecco's PBS | Sigma | D8662 | With calcium and magnesium chloride. Keep sterile and store at room temperature. |
| 1X Medium M199 | Gibco | 31150-022 | Warm in 37 °C water bath before use. |
| Gentamicin sulphate | Sigma | G1397 | Store at 4°C. Add to M199 500ml bottle. |
| Human epidermal growth factor | Sigma | E9644 | Store at -20°C in 10µl aliquots. |
| Fetal calf serum (FCS) | Sigma | F9665 | FCS must be batch tested to ensure the growth and viability of isolated EC. Heat inactivate at 56°C. Store in 10ml aliquots at -20°C. |
| Amphotericin B | Gibco | 15290-026 | Potent and becomes toxic within a week so fresh complete HUVEC medium must be made up every week. Store at -20°C in 1ml aliquots. |
| Hydrocortisone | Sigma | H0135 | Stock is in ethanol. Store at -20°C in 10µl aliquots. |
| Collagenase Type II | Sigma | C6885 | Dilute stock in PBS to a final concentration of 100mg/ml. Store at -20°C in 100µl aliquots. |
| Hyaluronidase | Sigma | H3631 | Dilute stock in PBS to a final concentration of 20,000U/ml. Store at -20°C in 100µl aliquots. |
| 100µm cell strainer for 50ml centifuge tube | Scientific Lab Supplies (SLS) | 352360 | Other commercially available cell strainers (e.g. Greiner bio-one) can also be used. |
| DMEM low glucose | Biosera | LM-D1102/500 | Warm in 37 °C water bath before use. |
| Penicillin/Streptomycin mix | Sigma | P4333 | Store at -20°C in 1ml aliquots. |
| 25cm2 tissue culture flask | SLS | 353109 | |
| 75cm2 tissue culture flask | SLS | 353136 | |
| Bone marrow mesenchymal stem cells vial | Lonza | PT-2501 | Store in liquid nitrogen upon arrival. Cells are at passage 2 upon arrival but are designated passage 0. Exapand to passage 3 and store in liquid nitrogen for later use. |
| Mesenchymal stem cell growth medium (MSCGM) | Lonza | PT-3001 | Warm in 37 °C water bath before use. For Cell Tracker Green staining use medium without FCS. |
| EDTA (0.02%) solution | Sigma | E8008 | Store at 4°C. Warm in 37°C water bath before use. |
| Trypsin solution | Sigma | T4424 | Store at -20°C in 2ml aliquots. Thaw at room temperature and use immediately. |
| Cryovials | Greiner bio-one | 2019-02 | Keep on ice before adding before adding cell suspension. |
| Mr. Frosty Freezing Container | Nalgene | 5100-0001 | Store at room temperature. When adding cryovials with cells store at -80°C for 24h before transfrring cells to liquid nitrogen. |
| Ibidi u-Slide VI (0.4), T/C treated, sterile | Ibidi | IB-80606 | Alternative models include glass capillaries, Cellix Biochips (www.cellixltd.com), BioFlux Plates (www.fluxionbio.com/bioflux/) and GlycoTech parallel plate flow chambers (http://www.glycotech.com/apparatus/parallel.html). |
| Cell tracker green dye | Life technologies | C2925 | Store in 5µl aliquots at -20°C. Dilute in 5ml prewarmed (at 37°C) MSCGM. |
| Cell counting chambers | Nexcelom | SD-100 | Alternatively a haemocytometer can be used. |
| Cellometer auto T4 cell counter | Nexcelom | Auto T4-203-0238 | |
| Tumor necrosis factor α (TNFα) | R&D Systems | 210-TA-100 | Dilute stock in PBS to a final concentration of 100,000U/ml. Store at -80°C in 10µl aliquots. |
| 6-well, 0.4µm PET Transwell filters | SLS | 353090 | |
| K2-EDTA in 10ml tubes | Sarstedt | Store at room temperature. | |
| Histopaque 1119 | Sigma | 11191 | Store at 4°C. Warm to room temperature before use. |
| Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | Store at 4°C. Warm to room temperature before use. |
| 10ml round bottomed tube | Appleton Woods | SC211 142 AS | |
| 7.5% BSA Fraction V solution | Life technologies | 15260-037 | Store at 4°C. |
| 20ml Plastipak syringes | BD falcon | 300613 | |
| 5ml Plastipak syringes | BD falcon | 302187 | |
| 2ml Plastipak syringes | BD falcon | 300185 | |
| 3M hypo-allergenic surgical tape 9m x 2.5cm | Micropore | 1530-1 | Use to secure the syringe tap onto the wall of the perspex chamber. |
| Silicon rubber tubing, internal diameter/external diameter (ID/OD) of 1/3mm (thin tubing) | Fisher Scientific | FB68854 | Cut silicon tubing to the appropriate size. All tubing leading directly to the electronic microvalve must be thin. |
| Silicon rubber tubing ID/OD of 2/4mm (thick tubing) | Fisher Scientific | FB68855 | |
| Portex Blue Line Manometer tubing | Smiths | 200/495/200 | Tubing leading to the syringe pump. |
| 3-way stopcock | BOC Ohmeda AB | ||
| Glass 50ml syringe for pump | Popper Micromate | 550962 | Must be primed prior to use by removing any air bubbles. |
| Glass coverslip | Raymond A Lamb | 26x76mm coverslips made to order. Lot number 2440980. | |
| Parafilm gasket | American National Can Company | Cut a 26x76mm piece of parafilm using an aluminium template and cut a 20x4mm slot into it using a scalpel 10a. Gasket thickness is approximately 133µm. | |
| Two perspex parallel plates | Wolfson Applied Technology Laboratory | Specially designed chamber consisting of parallel plates held together by 8 screws. The lower plate has a viewing slot cut out in the middle and a shallow recess milled to allow space for the coverslip, filter and gasket. The upper perspex plate has an inlet and outlet hole positioned over the flow channel. | |
| Electronic 3-way microvalve with min. dead space | Lee Products Ltd. | LFYA1226032H | Electronically connected to a 12 volt DC power supply. |
| Syringe pump for infusion/withdrawal (PHD2000) | Harvard Apparatus | 70-2001 | Set the diameter to 29mm and refill (flow) rate. |
| L-shaped connector | Labhut | LE876 | To attach to the inlet and outlet ports onto the Ibidi microslide channel. |
| Video camera | Qimaging | 01-QIC-F-M-12-C | Connected to a computer which enables digitall videos to be recorded. |
| Image-Pro Plus 7.0 | Media Cybernetics | 41N70000-61592 | For data analysis. Manually tag cells displaying the different behaviors. Track cells for analysis of rolling and migration velocities. |
| Refer to product datasheets for details on hazards of using the reagents described here. |
References
- Springer, T. A. Traffic signals on endothelium for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration. Ann. Rev. Physiol. 57, 827-872 (1995).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature reviews. Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
- McGettrick, H. M., Butler, L. M., Buckley, C. D., Rainger, G. E., Nash, G. B. Tissue stroma as a regulator of leukocyte recruitment in inflammation. Journal of leukocyte biology. 91 (3), 385-400 (2012).
- Serhan, C. N., Savill, J. Resolution of inflammation: the beginning programs the end. Nature immunology. 6 (12), 1191-1197 (2005).
- Schmidt, S., Moser, M., Sperandio, M. The molecular basis of leukocyte recruitment and its deficiencies. Molecular immunology. 55, 49-58 (2013).
- Luu, N. T., Rainger, G. E., Nash, G. B. Differential Ability of Exogenous Chemotactic Agents to Disrupt Transendothelial Migration of Flowing Neutrophils. The Journal of Immunology. 164 (11), 5961-5969 (2000).
- Smith, C. W., Rothlein, R., et al. Recognition of an endothelial determinant for CD 18-dependent human neutrophil adherence and transendothelial migration. The Journal of clinical investigation. 82 (5), 1745-1756 (1988).
- Luscinskas, F. W., Brock, A. F., Arnaout, M. A., Gimbrone, M. A. Endothelial-leukocyte adhesion molecule-1-dependent and leukocyte (CD11/CD18)-dependent mechanisms contribute to polymorphonuclear leukocyte adhesion to cytokine-activated human vascular endothelium. J. Immunol. 142 (7), (1989).
- Bahra, P., Rainger, G. E., Wautier, J. L., Nguyet-Thin, L., Nash, G. B. Each step during transendothelial migration of flowing neutrophils is regulated by the stimulatory concentration of tumour necrosis factor-alpha. Cell adhesion and communication. 6 (6), 491-501 (1998).
- Piali, L., Weber, C., et al. The chemokine receptor CXCR3 mediates rapid and shear-resistant adhesion-induction of effector T lymphocytes by the chemokines IP10 and Mig. European journal of immunology. 28 (3), 961-972 (1998).
- McGettrick, H. M., Smith, E., et al. Fibroblasts from different sites may promote or inhibit recruitment of flowing lymphocytes by endothelial cells. European journal of immunology. 39 (1), 113-125 (2009).
- McGettrick, H. M., Hunter, K., Moss, P. a., Buckley, C. D., Rainger, G. E., Nash, G. B. Direct observations of the kinetics of migrating T cells suggest active retention by endothelial cells with continual bidirectional migration. Journal of leukocyte biology. 85 (1), 98-107 (2009).
- McGettrick, H. M., Buckley, C. D., Filer, A., Rainger, G. E., Nash, G. B. Stromal cells differentially regulate neutrophil and lymphocyte recruitment through the endothelium. Immunology. 131 (3), 357-370 (2010).
- Tull, S. P., Yates, C. M., et al. Omega-3 Fatty acids and inflammation: novel interactions reveal a new step in neutrophil recruitment. PLoS biology. 7 (8), e1000177 (2009).
- Ahmed, S. R., McGettrick, H. M. Prostaglandin D2 regulates CD4+ memory T cell trafficking across blood vascular endothelium and primes these cells for clearance across lymphatic endothelium. Journal of immunology. 187 (3), 1432-1439 (2011).
- Bradfield, P. F., Amft, N., et al. Rheumatoid fibroblast-like synoviocytes overexpress the chemokine stromal cell-derived factor 1 (CXCL12), which supports distinct patterns and rates of CD4+ and CD8+ T cell migration within synovial tissue. Arthritis and rheumatism. 48 (9), 2472-2482 (2003).
- Filer, A., Parsonage, G., et al. Differential survival of leukocyte subsets mediated by synovial, bone marrow, and skin fibroblasts: site-specific versus activation-dependent survival of T cells and neutrophils. Arthritis and rheumatism. 54 (7), 2096-2108 (2006).
- Lally, F., Smith, E., et al. A novel mechanism of neutrophil recruitment in a coculture model of the rheumatoid synovium. Arthritis and rheumatism. 52 (11), 3460-3490 (2005).
- Chakravorty, S. J., McGettrick, H. M., Butler, L. M., Buckley, C. D., Rainger, G. E., Nash, G. B. An in vitro. model for analysing neutrophil migration into and away from the sub-endothelial space: Roles of flow and CD31. Biorheology. 43 (1), 71-82 (2006).
- Rainger, G. E., Nash, G. B. Cellular Pathology of Atherosclerosis Smooth Muscle Cells Prime Cocultured Endothelial Cells for Enhanced Leukocyte Adhesion. Circulation Research. 88 (6), 615-622 (2001).
- Kuravi, S. J., McGettrick, H. M. Podocytes regulate neutrophil recruitment by glomerular endothelial cells via IL-6-mediated crosstalk. Journal of immunology. 193 (1), 234-243 (2004).
- Parsonage, G., Filer, A. D. A stromal address code defined by fibroblasts. Trends in immunology. 26 (3), 150-156 (2005).
- Luu, N. T., McGettrick, H. M. Crosstalk between mesenchymal stem cells and endothelial cells leads to downregulation of cytokine-induced leukocyte recruitment. Stem cells. 31 (12), 2690-2702 (2013).
- Bevilacqua, M. P., Nelson, R. M., Mannori, G., Cecconi, O. Endothelial-leukocyte adhesion molecules in human disease. Annual review of medicine. 45, 361-378 (1994).
- Stanness, K. A., Beatty, P. G., Ochs, H. D., Harlan, J. M. An endothelial cell surface factor(s) induced in vitro. 136 (12), 4548-4553 (1986).
- Burton, V. J., Butler, L. M. Delay of migrating leukocytes by the basement membrane deposited by endothelial cells in long-term culture. Experimental cell research. 317 (3), 276-292 (2011).
- Luu, N. T., Rainger, G. E., Buckley, C. D., Nash, G. B. CD31 Regulates Direction and Rate of Neutrophil Migration over and under Endothelial Cells. Journal of Vascular Research. 40 (5), 467-479 (2003).
- McGettrick, H. M., Buckley, C. D., Ed Rainger, G., Nash, G. B. Influence of stromal cells on lymphocyte adhesion and migration on endothelial cells. Methods in molecular biology. 616, 49-68 (2010).
- Butler, L. M., McGettrick, H. M., Nash, G. B. Static and dynamic assays of cell adhesion relevant to the vasculature. Methods in molecular biology. 467, 211-228 (2009).
- Jeffery, H. C., Buckley, C. D., Moss, P., Rainger, G. E., Nash, G. B., McGettrick, H. M. Analysis of the effects of stromal cells on the migration of lymphocytes into and through inflamed tissue using 3-D culture models. Journal of immunological methods. 400-401, 45-57 (2013).
