This protocol describes NAME, an assay that allows the rapid identification of molecules able to inhibit in vitro the chaperone activities of HIV-1 nucleocapsid protein.
RNA eller DNA brettes i stabil tridimensional folding er interessante mål for utviklingen av antitumor eller antivirale midler. I tilfellet av HIV-1, virale proteiner som er involvert i reguleringen av virusaktivitet gjenkjenne flere nukleinsyrer. Nukleokapsidet protein NCp7 (NC) er et nøkkelprotein som regulerer flere prosesser i løpet av virusreplikasjon. NC er faktisk en anstand destabilisere de sekundære strukturer av RNA og DNA, og lette deres glødning. Inaktivering av NC er en ny tilnærming og et interessant mål for anti-HIV-behandling. N ucleocapsid A nnealing- M E-mediet lectrophoresis (NAME) assay ble utviklet for å identifisere molekyler i stand til å inhibere smelting og annealing av RNA og DNA brettes i termodynamisk stabile tridimensional konformasjoner, for eksempel hårnålstrukturer av tjære og cTAR elementer av HIV, etter nukleokapsidet proteinet av HIV-1. Den nye analysen benytter enten recombinant eller syntetisk protein, og oligonukleotider uten behov av deres tidligere merking. Analysen av resultatene oppnås ved standard polyakrylamid gelelektroforese (PAGE) etterfulgt av konvensjonell nukleinsyre farging. Av protokollen angitt i dette arbeidet beskriver hvordan å utføre NAME analysen med full-lengde proteinet eller dets forkortede versjonen som mangler den grunnleggende N-terminale domene, både kompetente som nukleinsyrer anstand, og hvordan man skal vurdere inhibisjon av NC anstand aktivitet ved en threading intercalator. Videre kan NAME utføres i to forskjellige moduser, som er nyttig for å oppnå indikasjoner på den antatte virkningsmekanisme av de identifiserte NC-inhibitorer.
Den nukleokapsid protein NCp7 (NC) av humant immunsviktvirus type 1 (HIV-1) er en liten, basisk protein som er tett forbundet med genomisk RNA i den modne infeksiøs virus, som spiller en sentral rolle i virusreplikasjon som en kofaktor i løpet av revers transkripsjon , genom gjenkjennelse og emballasje. 1-3 NC fungerer som en nukleinsyre anstand kata destabilisering av stabile nukleinsyre-konstruksjoner og annealing av komplementære sekvenser. Sin nukleinsyre aggregere aktivitet ligger først og fremst i de 11 aminosyrene N-terminal domene mens duplex destabiliserende virksomhet er kartlagt til sine sink finger strukturer (12-55 peptid). 4 Den positivt ladet protein senker elektro barrieren av annealing reaksjon og øker hastigheten ved hvilken to separate komplementære sekvenser kommer sammen.
Nukleinsyrer brettes i stabil konformasjon krever anstand aktiviteter av NC ytterligere å forenklee deres annealing 5 Dette er spesielt viktig ved revers transkripsjon, der NC er kritisk i trådoverføringsarrangementer.: i minus tråd overføring, minus tråd stopp DNA, bare retrotranscribed, må overføres og hybridisert til en komplementær sekvens i R-regionen ved 3'-enden av RNA-genomet mal. 6. Selv om termodynamisk favorisert, denne reaksjon ikke forekommer i stor utstrekning i fravær av NC på grunn av tilstedeværelsen av stabil struktur av trans aktivering responsive region (TAR) RNA i R regioner som må være knyttet til sin DNA-kopi (cTAR DNA). 7 cTAR og TAR er faktisk svært strukturerte regioner med en karakteristisk stilk-løkke konformasjon. NC protein denatures disse hårnåler, og fremmer minus-strand overføring ved å øke frekvensen av inter annealing mellom de komplementære nukleinsyrekjeder. Mekanismen for NC annealing av TAR og cTAR har blitt grundig undersøkt og derives som TAR annealing analysen i flere forskningsartikler og den foreslåtte ordningen er avbildet i gode anmeldelser. 8-11 oppsummerer, destabiliserer NC den sekundære strukturen stabil RNA som TAR-RNA, destabiliserer den sekundære strukturen i sin komplementære sekvens, cTAR-DNA og fremmer annealing omsetning av RNA / DNA fører til TAR / cTAR heterodupleks dannelse. 10,11 Som et resultat, blir strengen-overføringstrinnet under HIV-replikasjon foretrekkes. 12
NC er et attraktivt mål for utvikling av nye antivirale midler ettersom eventuelle forstyrrelser indusert av små molekyler mot NC ville resultere i en reduksjon av revers transkripsjon av det virale genomet som en konsekvens av en nedsatt NC aktivitet. 2,13 Denne tilnærmingen kunne til slutt føre til utviklingen av vellykkede anti-HIV-midler. I løpet av en screening for NC-hemmere 14 vi utviklet en analyse stole på de kjente egenskaperav nucleocapsid å effektivt destabilisere og annealing utfyllende oligonukleotider. 10,11 Vi kalte det N ucleocapsid En nnealing- M-mediet E lectrophoresis (NAVN) analysen. NAVN analysen benytter NC å mediere gløding mellom stabilt strukturerte kopier av komplementære nukleinsyrer, i vårt tilfelle av oligonukleotidet som svarer til den apikale del av en TAR-RNA-sekvens med dens komplementære DNA-sekvens (cTAR) for å gi den hybride TAR / cTAR heterodupleks . Analysen av TAR / cTAR annealing reaksjonen i nærvær av NC kan undersøkes ved mors polyakrylamid gelelektroforese (PAGE).
Denne protokollen viser hvordan man skal utføre NAME analysen raskt bindes ved romtemperatur oligonukleotider foldet i stabile hårnålstrukturer, å analysere resultatet av reaksjon og feilsøking av forsøket. Radioaktiv merking av nukleinsyren ikke er forespurt, og detectipå over oligonukleotid-bånd kan utføres ved konvensjonelle farvemetoder. Analysen, som anvender enten rekombinant full-lengde proteinet eller en forkortet versjon av syntetisk NC, muliggjør identifisering av gjenge interkalatorer som hemmer NC, en aktivitet som er vist å korrelere med sterk binding til RNA og DNA. 14
NAME er en metode som gjør det mulig raskt å vurdere inhibisjon av anstand aktivitet av nukleokapsid protein av HIV-1, en interessant mål i leting etter nye anti-HIV-medikamenter. NC hybridiserer raskt og ved romtemperatur nukleinsyrer som har stabil folding ellers ville kreve termiske denaturering ved høy temperatur etterfulgt av forsiktig gløding. Analysen kan utføres med enten full-lengde NC eller med trunkert (12-55) NC: i begge tilfeller de to nukleinsyrer (RNA og dens komplementære DNA-kopi) er glødet hurtig. Dette er i overensstemmelse med litteraturen observasjon med det avkortede NC peptid: annealing initieres ved effektiv smelting av stammen av cTAR fulgt av interaksjon av dens komplementære apikal løkke, som er en svak NC-bindingssete, sammen med den komplementære sekvens av TAR apikal sløyfe, havne gjennom flere ustabile mellomprodukter til den utvidede glødet hybrid. 21
NC er et meget stabilt protein og få problemer mens du utfører NAVN kunne forekomme. Det er veldig viktig, men å legge ferske SDS i Gel Loading Buffer brukt til å stoppe reaksjonen: Hvis dette ikke oppnås, vil geleen ikke vise nukleinsyresekvensene band på de riktige posisjonene. Faktisk, NC er en nukleinsyre-bindende protein, slik at for å visualisere fullstendig TAR / cTAR heterodupleks ved gelelektroforese SDS må være tilstede i gelen ladningsbuffer for å denaturere protein og frigjøre den fra sitt tette anlegg med nukleinsyrene. Dette er også en mulig feilsøking av forsøket, det vil si dannelsen av forskjøvne bånd i gelen løp. Denne effekten er spesielt tydelig når full-lengde NC ble anvendt, som i figur 2, og er knyttet til tilstedeværelsen av den meget basisk N-terminal hale, som har en sterk aggregerende effekt på nukleinsyrer.
Tilstedeværelsen av terminalen grunn halen gjør annealing reaksjonen vanskeligere å bli inhibert, som vistn i figur 3 ved hjelp av sammensatte en, en representant threading intercalator, dvs. en intercalator spesielt effektiv på å stabilisere Scammeløkke-strukturer av TAR og av cTAR. Faktisk er denne type samhandling med nukleinsyrer favorisert når buler og looper avbryte dobbeltspiralen kontinuitet, noe som åpner for en enklere threading av voluminøse substituenter i basepar. Stabilisering av tjære og cTAR av disse nukleinsyre-bindemidler ble tidligere analysert ved bestemmelse av økningen i smeltetemperaturen for de to oligonukleotider. 14 Dessuten korrelerer økningen i smeltetemperatur med inhibering av annealing katalysert av HIV-1 NC, fører til redusert dannelse av heterodupleks TAR / cTAR og indikerer at gjenge interkalatorer er en interessant klasse av bindemidler for dynamiske strukturer av RNA som TAR-elementet. 14
Virkningsmekanismen påberopes for disse compounds kan videre bekreftet ved å utføre NAME analyse i forskjellige alternative formater, slik som vist i figur 4: i tilfellet med interkalatorer inhiberingen av glødet heterodupleks forsterkes når medikamentet blir inkubert med de to brettede oligoer. Forbindelser som virker med annen virkningsmekanisme, for eksempel direkte bindemidler for NC protein, ville være mindre påvirket av de ulike preinkubasjon modus. NAME assay utføres i de to fremgangsmåter kan derfor brukes til å screene bibliotekene av forbindelser for identifisering av NC-inhibitorer, og også for å vurdere den antatte virkningsmekanismen til de positive treff under søking etter anti-HIV-legemidler rettet mot NC. Åpenbart er bruken av disse teknikkene alene ved krav om for en spesifikk virkningsmekanisme av identifiserte NC-inhibitorer ikke er tilstrekkelig, og andre egnede biokjemiske analyser er nødvendig for å opprettholde arbeidshypotese. 14
Til slutt må det understrekes at NAME bruker sværtrensede enzymer, enten rekombinante eller syntetiske, som gir verdifull informasjon om den "in vitro" hemning av NC av de testede forbindelser. Dette er "styrke og svakhet" av analysen: NAVN kan godt utfylle virtuelle screening og molekylær modellering tilnærminger i de innledende skritt for narkotikaforskning programmer, slik at for raskt å bygge og analysere struktur-aktivitetsforhold og til slutt omdirigere syntese og drug design. Men som andre biokjemiske analyser som brukes i narkotika utviklingsprosjekter i HIV, NAME vil ikke gi informasjon om virkningene av mulige hemmere i virusinfiserte celler.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by Ministero degli Affari Esteri (MAE, DRPG, Unità per la cooperazione scientifica e tecnologica, Grant: PGR Italy-USA) and by MIUR, Progetti di Ricerca di Interesse Nazionale (Grant: 2010W2KM5L_006).
Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
cTAR, 29-mer DNA oligo. Desalted. HPLC purified. | Metabion International AG | Store the stock solution at -20 °C | |
TAR, 29-mer RNA oligo. Desalted. HPLC purified. | Metabion International AG | Store the stock aliquot at -80 °C | |
(12-55)NC peptide | EspiKem srl | Store the stock solution at -20 °C | |
1.5 mL tubes | Eppendorf | 0030 120 086 | Autoclave before use |
0.5 mL tubes | Eppendorf | 0030 121 023 | Autoclave before use |
Biosphere Filter Tips 0.1-10 µL | Sarstedt | 701,130,210 | |
Biosphere Filter Tips 2-20 µL | Sarstedt | 70,760,213 | |
Biosphere Filter Tips 200 µL | Sarstedt | 70,760,213 | |
Syringe Filter 0,22 µm | Biosigma srl | 51,798 | |
Ethanol | Carlo Erba | 414631 | |
Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich | 71725-50G | |
Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418-1L | |
Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | 71376-1KG | |
Boric Acid | Sigma-Aldrich | B0252-2.5KG | |
Ethylenediaminetetraacetic Acid | Sigma-Aldrich | E5134-500G | |
Magnesium Perchlorate | Sigma-Aldrich | 222283-100G | Store the 1M solution at -20°C |
Glycerol | Sigma-Aldrich | 49770-1L | |
Bromophenol Blue | GE Healthcare Life Sciences | 17-1329-01 | |
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine | Sigma-Aldrich | T9281-100ML | |
Ammonium Persulfate | Sigma-Aldrich | A7460-500G | Prepare the 10% solution freshly before use |
Acrylamide-bis ready-to-use solution 40% (19:1) | Merck Millipore | 1006401000 | Polyacrylamide is highly neurotoxic: wear gloves during the gel casting |
Tris ultrapure | Applichem | A1086,1000 | |
DEPC-treated water | Ambion | AM9922 | |
Centrifuge 5415R | Eppendorf | 22,621,408 | |
NanoDrop 1000 spectrometer | Thermo Scientific | ||
UV-VIS spectrometer Lambda 20 | Perkin Elmer | ||
Protean II xi Cell | Bio-Rad | 165-1803 | |
PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 164-5050 | |
SybrGreen II RNA Gel Staining | Lonza | 50523 | Make the 1/10000 dilution in TBE 1X. Store it in the dark at 4°C for two weeks |
Geliance 600 Imaging System | Perkin Elmer |