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Immunology and Infection

Nucleocapsid Glühen-vermittelte Elektrophorese (NAME) Assay ermöglicht die schnelle Identifizierung von HIV-1-Inhibitoren Nucleocapsid

Published: January 19, 2015
doi:
10.3791/52474
, , ,
1Department of Pharmaceutical and Pharmacological Sciences,University of Padova, 2The RNA Institute,SUNY Albany

Summary

This protocol describes NAME, an assay that allows the rapid identification of molecules able to inhibit in vitro the chaperone activities of HIV-1 nucleocapsid protein.

Abstract

RNA oder DNA in stabile dreidimensionale Faltung gefaltet sind interessante Ziele für die Entwicklung von Antitumor oder antivirale Medikamente. Im Fall von HIV-1, virale Proteine ​​in die Regulation der Virusaktivität beteiligt erkennen mehreren Nukleinsäuren. Die Nukleokapsidprotein NCp7 (NC) ist ein Schlüsselprotein der Regulierung mehrere Prozesse während der Virusreplikation. NC ist in der Tat ein Chaperon Destabilisierung der Sekundärstrukturen von RNA und DNA und deren Annealing erleichtern. Die Inaktivierung von NC ist ein neuer Ansatz und ein interessantes Ziel für die HIV-Therapie. Die N ucleocapsid A nnealing- M ediated E lectrophoresis (NAME) Assay wurde entwickelt, um Moleküle, die das Schmelzen und Glühen von RNA und DNA in thermodynamisch stabile dreidimensionale Konformationen, wie Haarnadelstrukturen von Teer und CTAR Elemente HIV gefalteten inhibieren, durch das Nucleocapsid-Protein von HIV-1. Der neue Test verwendet entweder die Wiederrekombinante oder synthetische Proteine ​​und Oligonukleotide, ohne die Notwendigkeit der vorherigen Markierung. Die Analyse der Ergebnisse wird durch Standard-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE), gefolgt von herkömmlichen Nucleinsäure Beizung. Das Protokoll, in dieser Arbeit berichtet, beschreibt, wie der Name Assay mit dem Protein voller Länge oder seine verkürzte Version fehlt die grundlegende N-terminale Domäne durchzuführen, sowohl kompetent als Nukleinsäuren Chaperone, und wie man die Hemmung der NC-Chaperon-Aktivität durch eine Beurteilung Gewinde Interkalator. Außerdem kann BEZEICHNUNG in zwei verschiedenen Modi durchgeführt werden, nützlich, um Hinweise auf die mutmaßlichen Wirkungsmechanismus der identifizierten NC-Inhibitoren erhalten.

Introduction

Die Nukleokapsidprotein NCp7 (NC) des humanen Immundefizienz-Virus Typ 1 (HIV-1) ist eine kleine, basische Protein, das eng mit der genomischen RNA in den reifen infektiösen Virus verbunden ist, spielt eine zentrale Rolle bei der Virusreplikation als Cofaktor während der reversen Transkription Genomerkennung wirkt und Verpackung. 1-3 NC als Nukleinsäure Chaperon Katalyse der Destabilisierung stabile Nukleinsäurestrukturen und die Annealing von komplementären Sequenzen. Seine Nukleinsäure Aggregieren Aktivität liegt vor allem in den 11 Aminosäuren N-terminalen Domäne, während die Duplex destabilisieren Aktivität in seine Zinkfingerstrukturen (12-55 Peptid) kartiert. 4 Die positiv geladenen Protein verringert die elektrostatische Barriere der Annealing-Reaktion und erhöht die Rate, bei der zwei getrennte komplementäre Sequenzen zusammen.

Nukleinsäuren in stabile Konformation gefaltet erfordern die Chaperon-Aktivitäten der NC zu facilitate ihrem Glühen 5 Dies ist besonders wichtig bei der reversen Transkription, wobei NC ist kritisch in Strangtransferereignisse. im Minusstrang übertragen, der Minus-Strang-DNA-Anschlag, so retrotranskribierten muss im Bereich R überführt und an eine komplementäre Sequenz geglüht am 3'-Ende des RNA-Genoms Vorlage. 6 zwar thermodynamisch bevorzugt, diese Reaktion nicht weitgehend in Abwesenheit von NC treten aufgrund der Gegenwart des stabilen Struktur der trans-Aktivierung ansprechenden Bereich (TAR) RNA in den R-Regionen, das muss seine DNA-Kopie (CTAR DNA). 7 CTAR und TAR sind in der Tat sehr strukturierte Bereiche mit einer charakteristischen Stamm-Schleifen-Konformation verbunden sein. NC-Protein denaturiert diese Haarnadeln und fördert Minusstrang Übertragung durch Erhöhung der Geschwindigkeit der interGlühen zwischen den komplementären Nukleinsäuresträngen. Der Mechanismus der NC Glühen von TAR und CTAR ist gut untersucht und deals TAR Glühen Test in mehreren Forschungsarbeiten beschrieben und die vorgeschlagene Regelung ist in sehr guten Bewertungen dargestellt. 8-11 Zusammenfassen, NC destabilisiert die Sekundärstruktur der RNA stabil wie TAR-RNA, destabilisiert die Sekundärstruktur von ihrer komplementären Sequenz, CTAR-DNA und fördert die Annealingreaktion der RNA / DNA, die zu TAR / CTAR Heteroduplexbildung. 10,11 Als Ergebnis wird der Strang-Transferschritt während der HIV-Replikation bevorzugt. 12

NC ist ein attraktives Ziel für die Entwicklung neuer antiviraler Mittel, da die mögliche Interferenz durch kleine Moleküle zu NC induziert würde zu einer Verringerung der reversen Transkription des viralen Genoms als Folge einer Beeinträchtigung des NC-Aktivität resultieren 2,13. Dieser Ansatz könnte schließlich zur Entwicklung von erfolgreichen HIV-Mittel zu führen. Im Verlauf eines Screening für die NC-Hemmer 14 wir einen Assay unter Berufung auf den bekannten Eigenschaften entwickeltvon Nukleokapsid effizient destabilisieren und Glühen komplementären Oligonukleotiden. 10,11 Wir nannten es N ucleocapsid A nnealing- M ediated E lectrophoresis (NAME) Assay. BEZEICHNUNG Assay verwendet, um den NC Glühen zwischen stabil strukturierte Kopien von komplementären Nukleinsäuren zu vermitteln, in unserem Fall der Oligonukleotide der apicalen Teil eines TAR-RNA-Sequenz mit ihrer komplementären DNA-Sequenz (CTAR), um das Hybrid TAR / CTAR Hetero Ausbeute . Die Analyse des TAR / CTAR Annealingreaktion in Gegenwart von NC kann durch native Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) untersucht werden.

Dieses Protokoll zeigt, wie der Name Assay schnell glühen bei Raumtemperatur Oligonukleotide in stabile Haarnadelstrukturen gefaltet durchzuführen, wie man den Ausgang der Reaktion und mögliche Fehlersuche des Experiments analysieren. Die radioaktive Markierung der Nukleinsäure nicht angemeldet ist, und Detektiveauf der Oligonukleotid Bänder können nach üblichen Färbeverfahren durchgeführt werden. Der Assay, der entweder das rekombinante Protein in voller Länge oder eine abgeschnittene synthetische Version des NC verwendet, ermöglicht die Identifizierung von Gewinde Interkalatoren Hemmung NC, eine nachweislich mit starker Bindung an RNA und DNA korreliert Aktivität. 14

Protocol

1. Herstellung von Material, Nukleinsäuren und Proteine Nucleic Acids Autoklavieren Sie die 1,5-ml-Röhrchen und speichern sie in einem sterilen Behälter. Führen Sie jeden Schritt mit sterilen Filterspitzen zu beseitigen gefährdend Mitteln, zum Beispiel Nukleasen aus Laborverbrauchsmaterialien. Bereiten Tris-HCl 10 mM pH 7,5 in DEPC-behandeltem Wasser und filtriert die Lösung mit einem 0,22 um Porengrße-Filter. ANMERKUNG: Das Oligonukleotid als "TAR" entspricht der kurzen (29-mer) RNA-Sequenz 5'-GGCAGAUCUGAGCCUGGGAGCUCUCUGCC-3 '15 während CTAR ist seine komplementäre DNA-Sequenz 5'-GGCAGAGAGCTCCCAGGCTCAGATCTGCC-3'. Löslich sowohl TAR und CTAR in Tris-Puffer oben genannten (1.1.2.) Auf 100 & mgr; M Stammlösungen zu machen. Speicher CTAR Stammlösung bei -20 ° C (Aliquots können Monate unter diesen Bedingungen gelagert werden). Für eine langfristige Lagerung von RNA, stellen 20 ul Aliquots der TARStammlösung, trocknen Jedes Aliquot mit einem Vakuum-Konzentrator-Zentrifuge und lagern Sie sie bei -80 ° C. Frisch vor der Anwendung resuspendieren jedes TAR Aliquot in 20 ul DEPC-behandeltem Wasser. HINWEIS: Arbeits TAR Aliquots bei -20 ° C für zwei Wochen gelagert werden. NC-Protein und (12-55) NC-Peptid Bereiten Sie die rekombinanten Volllängen-NC-Protein, wie berichtet. 16 Shop der Stammlösung bei -20 ° C. Ermitteln Sie die genaue Proteinkonzentration mit einem UV-Vis-Spektralphotometer unter Verwendung eines Extinktionskoeffizienten bei 280 nm von 6410 M -1 cm -1. Resuspendieren des Kunst (12-55) NC-Peptid in Tris-HCl 10 mM pH 7,5 und speichern Sie die Stammlösung bei -20 ° C. Bestimmen Sie die richtige Peptidkonzentration auf einem UV-Vis-Spektralphotometer unter Verwendung eines Extinktionskoeffizienten bei 280 nm von 5700 M -1 cm -1. HINWEIS: Die (12-55) NC Peptids erhalten HPLC gereinigt und lyophaus einer Lösung, die zwei Äquivalente Zinkchlorid ilized. Verbindung 1 Wiegen etwa 1 mg der lyophilisierten Verbindung 1 mit einer Analysenwaage und löst ihn in 100 & mgr; l 100% DMSO, opportunely gewogen, um eine hohe Konzentration (≈10 mM) Stammlösung zu erhalten. Ermitteln Sie die genaue Konzentration der Verbindung auf einem UV-Vis-Spektralphotometer mit seinem Extinktionskoeffizienten (bei ​​354 nm: 11.387 M -1 cm -1). Bewahren Sie die Stammlösung im Dunkeln bei -20 ° C vor der Verwendung. 2. Einrichten von Gel Geräte und Gießen des Gel So richten Sie das Gel gründlich zwei Platten (eine lange und eine kürzere) mit 70% Ethanol, lassen Sie sie trocknen, und dann legen Sie zwei 1 mm-Abstandshalter entlang der langen Kanten der längeren Platte; bedecken Sie es mit dem Kurzschild, und stellen Sie sicher, um die zwei Platten am Boden ausrichten. Um das Gel gegossen, folgen Sie den Anweisungen des supp bereitgestelltlier (verschiedenen Anbietern verwenden etwas andere Apparate; Sandwich-Klemmen und Stacks werden von jedem Gussvorrichtung zur Verfügung gestellt). In jedem Fall sicher sein, dass Klemmen, Stapeln und Dichtungen sind sauber, und Spuren von Acrylamid von früheren Benutzern links entfernen. Legen Sie die zusammengebauten Gel-Sandwich in der Gussständer und folgen spezifische Anweisungen des Lieferanten. HINWEIS: In der Regel eine saubere Silikondichtung am Boden der Guss Schlitz gewährleistet eine gute Dichtung und trägt zur Vermeidung von Lecks beim Ausgießen des Gels. Um auf Dichtheit zu überprüfen, zu gießen destilliertem Wasser mit einer Pipette zwischen den Glasplatten. Mit Wasser bis füllen Sie das Sandwich und warten Sie einige Minuten, um sicherzustellen, dass keine Leckagen auftreten. Wenn das Sandwich ist richtig montiert, entfernen Sie das Wasser und legen Sie eine Filterpapier zwischen den beiden Gläsern die Gläser trocknen. Entfernen Sie das Papier, und jetzt das Sandwich ist bereit für Gelgießen. Gießen Gel bei Raumtemperatur (RT, 25 ° C). Seit Polyacrylamid ist sehr neurotoxische, Handschuhe. Unse Dauer 12% igen Polyacrylamidgelen in Nicht-Denaturierung (nativ) Bedingungen an NAME Assay durchzuführen. Bereiten Sie den 12% Gel-Lösung: Mischen 12 ml 40% Acrylamid / Bisacrylamid (19/1) Lösung, 4 ml TBE 10x Puffer (10x: Tris-HCl 890 mM Borat 890 mM, EDTA 20 mM) und 24 ml MilliQ-Wasser . Fügen Sie 400 ul APS und 50 ul TEMED unmittelbar vor der Verwendung. Mischen Sie die Lösung schnell und mit einem Pipette, um die Lösung zwischen den Glasplatten regnen. Führen Sie den Kamm zwischen den Glasplatten, die Vermeidung von Blasen. In Gel-Lösung, um das Sandwich zu füllen. Lassen Sie das Gel polymerisiert 45 Minuten bis 1 Stunde. Unmittelbar vor der Probenbeladung, nehmen Sie den Kamm langsam und spülen Brunnen gründlich mit destilliertem Wasser. Nach der Polymerisation und Brunnen Spülschritte, befolgen Sie die Anweisungen des Lieferanten, um das Gel-Sandwich in der Vorrichtung für die vertikale Gelelektrophorese zu platzieren. Wenn ein Kühlsystem vorhanden ist, stellen Sie sicher, um die Gel-System in der cor legenrect Position des Kühlkern. Wenn das System ausgelegt ist, um mehr als ein Gel zu behandeln, aber nur ein Gel ausgeführt werden, schließen ein Gelsandwich als Beckens zum Kühlkern auf der anderen Seite, um die komplette obere Pufferkammer zu bilden. HINWEIS: Wenn der Damm nicht korrekt platziert, wird der obere Puffer möglicherweise undicht Stoppen des Gellaufs. Bereiten 2,5 l TBE Laufpuffer (1x: Tris-HCl 89 mM, 89 mM Borat, 2 mM EDTA) in deionisiertem Wasser. Abheben ca. 500 ml TBE-Puffer für die obere Pufferkammer und gießen Sie den Rest in die untere Pufferkammer. Gießen Sie die restliche 500 ml TBE-Puffer in die obere Pufferkammer. Aufsetzen des Deckels auf der Oberseite der unteren Pufferkammer, so dass die Anode und die Kathode sind an der entsprechenden Position. Schließen Sie das Kühlkern, falls vorhanden, an einen Wasserhahn mit Schläuchen. Füllen Sie den Kern mit Leitungswasser, das als Kühlkörper während der Elektrophorese dienen soll, und lassen Sie Leitungswasser zirkulieren durch den Kern bei der Auserwähltenrophoresis. 3. Nucleocapsid Glühen vermittelte Elektrophorese (NAME) Assay Vorbereitung der Puffer Bereiten TNMG Puffer (1x: Tris-HCl 10 mM, NaCl 20 mM, Mg (ClO 4) 2 1 mM, pH 7,5) in DEPC-behandeltem Wasser und filtriert die Lösung mit einem 0,22 um Porengrße-Filter. HINWEIS: TNMG Puffer bei 4 ° C für bis zu 7 Tage gelagert werden. Für beste Falten und Glühen Ergebnisse empfehlen wir die Verwendung von frisch zubereiteten Puffer. Bereiten Sie die Gelladepuffer enthalten SDS (GLB SDS: Tris-HCl 100 mM, EDTA 4 mM, 50% w / v Glycerol, 2% w / v SDS, 0,05% w / v Bromphenolblau) in DEPC-behandeltem Wasser. HINWEIS: GLB hilft, zu verfolgen, wie weit die Oligonukleotide Proben in das Gel System ausgeführt werden und ermöglicht es, die Proben in das Gel zu versenken. Zugabe von SDS zum GLB ist ein kritischer Schritt für die optimale Erfolg BEZEICHNUNG Assay. Wenn dieser Schritt nicht befolgt wird, ist es nicht möglich, Nukleinsäuren Band in der ge unterscheidenl-System (Abbildung 2). Steuert Vorbereitung Verdünnen seriell der Oligonukleotide Stammlösungen und nutzen frisch zubereiteten 10 uM Lösungen zu 10 ul einer 1 uM Lösung von TAR vorzubereiten. Herzustellen, in der gleichen Weise getrennt, 10 & mgr; l einer 1 & mgr; M in CTAR TNMG 1x Puffer. Erwärmen jedes Rohr auf 95 ° C für 5 min und dann lässt man auf RT damit TAR und CTAR abkühlen ihre Stamm-Wulst-Schleifenstrukturen annehmen. Bereiten 1 uM Lösung von Hybrid TAR / CTAR als Kontrolle. Mix 1 & mgr; l von 10 & mgr; M TAR mit 1 ul 10 uM CTAR in TNMG 1x, in einem Gesamtvolumen von 10 ul. Denaturierung der Oligonucleotide durch Erhitzen des Rohres auf 95 ° C für 5 min und lassen Sie sie langsam auf RT abkühlen, damit TAR an ihre komplementäre Sequenz anzulagern CTAR und die doppelsträngigen Hybrid TAR / CTAR bilden. Wenn die Lösungen werden auf Raumtemperatur gekühlt, führen eine Short-spin Zentrifugieren. In 3 ul GLB SDS, Pipette each Lösung in der Röhre 3-mal, das Glas auf Eis. Halten Sie die Kontrollproben stetig auf Eis, bis die Ladeschritt. Die Proben der Vorbereitung bis zur NC-Protein und (12-55) NC Peptidaktivität analysieren Verwenden Sie 2,5 ul frisch zubereiteten 4 uM Oligonukleotid-Lösung für jede Probe. Immer bereiten ein wenig überschüssige Menge jeder Lösung Pipettierfehler zu verhindern. Falten 32,5 ul 4 uM Lösung von TAR und getrennt von CTAR in TNMG 1x Puffer wie für die Kontrollzubereitung oben erwähnt berichtet (Schritt 3.2.1.). Von der Stammlösung der beiden NC-Protein und (12-55) NC-Peptid zu 80 uM Lösung mit MilliQ-Wasser. Wenn TAR und CTAR Lösungen werden auf Raumtemperatur abgekühlt, führen Sie eine Short-spin Zentrifugation der beiden Rohre und starten Sie die Vorbereitung der Proben Rohre. Bereiten Sie 12 leere 0,5 ml autoklaviert Rohre. Platz 3 Reihen von 4 Röhrchen im Rack für Laborproben. Jede Zeile zeigt jeweils die Proben zu analysieren the voller Länge NC-Protein, die Proben ohne Protein und die Proben zur Analyse der (12-55) NC Peptidaktivität. Tauschen Sie immer Tipps zu jeder Zeit eine andere Reagenz verwendet. Hinzufügen in jedem Röhrchen 2,5 ul gefalteten TAR und 2,5 ul gefalteten CTAR. In 4 ul DEPC-behandeltem Wasser zu den Proben für die Analyse von NC und der (12-55) NC. In 5 ul DEPC-behandeltem Wasser zu den anderen Proben. 1 ul von 80 uM oder NC 1 ul von 80 uM (12-55) NC zu den Proben für jeweils NC oder (12-55) NC-Analyse. Schnell in 3 ul GLB SDS den Zeitpunkt 0 min Proben (als 0 gemeldet 'in Figur 1), Pipettieren der Lösung in jedem Röhrchen 3 mal, und endlich die Röhrchen auf Eis. Wiederholen Sie diesen Schritt für alle Proben und Kontrollen. Bewahren Sie die Proben stabil auf Eis, bis die Ladeschritt. Nach 15 min, 30 min und 1 h Inkubation bei RT, fügen Sie 3 ul GLB SDS, pipettieren Sie die Lösung innerhalb each Rohr 3 mal, das Glas auf Eis. Wiederholen Sie diesen Schritt für alle Proben und Kontrollen sind, und auf Eis zu halten, bis der Ladeschritt. Nehmen Sie den Deckel des Gels Gerät. Last 13 ul jeder Probe in die Vertiefungen ausgebildet sind, wie zuvor durch Gießen des Gels mit einem gut bildende Kamm beschrieben. Laden Sie die Proben in der Reihenfolge in Abbildung 1 zu sehen. Setzen Sie den Deckel des Gels Gerät. Befestigen der Leitungen des Gels Vorrichtung an die Stromversorgung. Überprüfen Sie, ob die Elektroden in den richtigen Steckplätzen in der Stromversorgung angeschlossen ist. Schalten Sie den Strom und führen das Gel für 2 h und 30 min lang bei einer konstanten Spannung von 200 V, bis der Farbstoff auf 1,5 cm über dem Boden des Gels gewandert. Probenvorbereitung zu Anthrachinon Aktivität auf NC und (12-55) NC analysieren Verdünnen Sie die Verbindung 1-Stammlösung. Herstellung von 10 & mgr; l der 500 & mgr; M, 250 & mgr; M, 50 & mgr; M, 5 & mgr; M Verdünnung der Verbindung <strong> 1 in MilliQ-Wasser. Bereiten Kontrollproben wie oben beschrieben (Abschnitt 3.2.). Verwenden Sie 2,5 ul frisch zubereiteten 4 uM Oligonukleotid-Lösung für jede Probe. Immer bereiten ein wenig überschüssige Menge jeder Lösung Pipettierfehler zu verhindern. Falten 27,5 ul 4 uM Lösung von TAR und getrennt von CTAR in TNMG 1x Puffer wie oben erwähnt (Schritt 3.2.1.). Von der Stammlösung der beiden NC-Protein und (12-55) NC-Peptid zu 80 uM Lösung in Wasser. Wenn TAR und CTAR Lösungen werden auf Raumtemperatur abgekühlt, führen Sie eine Short-spin Zentrifugation der beiden Rohre und starten Sie die Vorbereitung der Proben. Es werden 20 leere 0,5 ml autoklaviert Rohre. Platz 2 Reihen mit je 10 Röhrchen im Rack für Laborproben. Tauschen Sie immer Tipps zu jeder Zeit eine andere Reagenz verwendet. Fügen jedes Rohr der ersten Reihe mit 2,5 ul gefalteten TAR. Fügen Sie jedes Rohr der zweiten Reihe mit 2,5 ul gefaltet CTAR. <li> Add 2 ul der entsprechenden Verbindung 1-Verdünnung (steigende Konzentration von den 5 uM bis 500 uM der Verdünnung) zu TAR und CTAR. Ersetzen Verbindung mit Wasser in den Proben für die Analyse von NC und (12-55) NC in Abwesenheit der Verbindung. Inkubieren der Proben für 15 min bei RT. Nach 15 min Inkubation mischen die CTAR Proben (Rohre zweite Reihe) mit den Korrespondenten TAR Proben (Rohre aus der ersten Reihe). 1 ul von 80 uM oder NC 1 ul von 80 uM (12-55) NC zu den Proben für die NC oder (12-55) NC-Analyse auf. Nach 15 min Inkubation hinzufügen 3 ul GLB SDS, pipettieren jedes Rohr 3 mal, das Glas auf Eis. Wiederholen Sie diesen Schritt jeweils mit den Proben für die NC und (12-55) NC-Analyse. Bewahren Sie die Proben stabil auf Eis, bis die Ladeschritt. Nehmen Sie den Deckel des Gels Gerät. Laden 13 ul jeder Probe in die Vertiefungen. Laden Sie die Proben nach der Reihenfolge, in Abb berichteture 3B. Setzen Sie den Deckel des Gels Gerät. Befestigen der Leitungen des Gels Vorrichtung an die Stromversorgung. Überprüfen Sie, ob die Elektroden in den richtigen Steckplätzen in der Stromversorgung angeschlossen ist. Schalten Sie den Strom und führen das Gel für 2 h und 30 min lang bei einer konstanten Spannung von 200 V, bis der Farbstoff auf 1,5 cm über dem Boden des Gels gewandert. Probenvorbereitung: Oligo Vorinkubation-Modus vs NC-Vorinkubation Modus Verdünnen Sie die Verbindung 1-Stammlösung. Herstellung von 10 & mgr; l der 500 & mgr; M, 250 & mgr; M, 50 & mgr; M, 5 & mgr; M Verdünnung der Verbindung 1 in MilliQ Wasser. Bereiten Kontrollproben wie oben beschrieben (Abschnitt 3.2.). In 2,5 ul 4 uM Oligonucleotidlösung für jede Probe. Immer bereiten ein wenig überschüssige Menge jeder Lösung Pipettierfehler zu verhindern. Falten 27,5 ul 4 uM Lösung von TAR und getrennt von CTAR in TNMG 1x Puffer wie oben erwähnt (Schritt 3.20,1.). Von der Stammlösung der beiden NC-Protein und (12-55) NC-Peptid zu 80 uM Lösung in Wasser. Wenn TAR und CTAR Lösungen werden auf Raumtemperatur abgekühlt, führen Sie eine Short-spin Zentrifugation der beiden Rohre und starten Sie die Vorbereitung der Proben. Tauschen Sie immer Tipps jedes Mal Reagenzien verändert werden oder wenn eine andere Flüssigkeit oder Lösung in dem Reaktionsrohr enthaltenen berührt wird. Von diesem Schritt stellen Sie sicher, eindeutig zu kennzeichnen und trennen Sie die Proben für die beiden unterschiedlichen Vorinkubation Verfahren. Oligo-Vorinkubation Modus Bereiten Sie 10 leere 0,5 ml autoklaviert Rohre. Platz 2 Reihen von 5 Röhrchen im Rack für Laborproben. Hinzufügen in jedem Rohr der ersten Reihe 2,5 ul gefalteten TAR. Hinzufügen in jedem Rohr der zweiten Reihe 2,5 ul gefalteten CTAR. Add 2 ul der entsprechenden Verbindung 1-Verdünnung (steigende Konzentration von den 5 uM bis 500 uM der Verdünnung) zu TAR und CTAR.Ersetzen Verbindung mit Wasser in den Proben für die Analyse des NC in Abwesenheit der Verbindung. Inkubieren der Proben für 15 min bei RT. Nach 15 min Inkubation, nehmen Sie die CTAR Proben (zweite Reihe) und setzte sie mit den Korrespondenten TAR Proben (erste Reihe). 1 ul 80 uM NC zu jeder Probe und inkubiere die Proben für 15 min bei RT. Nach 15 min Inkubation hinzufügen 3 ul GLB SDS, pipettieren jedes Rohr 3 mal, das Glas auf Eis. Bewahren Sie die Proben stabil auf Eis, bis die Ladeschritt. NC-Vorinkubation Modus Bereiten Sie 5 leere 0,5 ml autoklaviert Rohre und legen Sie sie in das Rack für Laborproben. Hinzufügen in jedem Röhrchen wurden 4 ul der geeigneten Verbindung 1 Verdünnung (steigende Konzentration von 5 & mgr; M bis 500 & mgr; M verdünnt). Ersetzen Verbindung mit Wasser in den Proben für die Analyse des NC in Abwesenheit der Verbindung. Hinzufügen in jedem Röhrchen 1 & mgr; l von 80 μ; M NC und Inkubation der Proben für 15 min bei RT. Mischungs 15 ul gefalteten TAR mit 15 ul gefalteten CTAR in einem Rohr und diese TAR + CTAR Lösung im nächsten Schritt. Nach 15 Minuten Inkubation wurden zu jeder Probe 5 ul der TAR + CTAR Mischlösung hinzu und inkubiere die Proben für 15 min bei RT. Nach 15 min Inkubation hinzufügen 3 ul GLB SDS, pipettieren jedes Rohr 3 mal, das Glas auf Eis. Bewahren Sie die Proben stabil auf Eis, bis die Ladeschritt. HINWEIS: Vom Schritt 3.5.8 auf, kann die Analyse mit allen Proben (Wiederaufnahme aus 3.5.7) durchgeführt werden. Nehmen Sie den Deckel des Gels Gerät. Laden 13 ul jeder Probe in die Vertiefungen. Laden Sie die Proben in der Reihenfolge in Abbildung 4 angegeben. Setzen Sie den Deckel des Gels Gerät. Befestigen der Leitungen des Gels Vorrichtung an die Stromversorgung. Überprüfen Sie, ob die Elektroden in den richtigen Steckplätzen im Leistungs suppl gesteckty. Schalten Sie den Strom und führen das Gel für 2 h und 30 min lang bei einer konstanten Spannung von 200 V, bis der Farbstoff auf 1,5 cm über dem Boden des Gels gewandert. 4. Entfernen der Gel und Gelfärbung Nach der Elektrophorese, schalten Sie die Stromversorgung aus, und ziehen Sie die elektrischen Leitungen. Drehen Sie den Wasserhahn des Kühlsystems und trennen Schläuche aus dem Kern. Entfernen Sie den Deckel, und, wenn das System abgekühlt wurde, entfernen Sie das Kühlkern und gießen Sie den Puffer aus beiden Kammern. Demontieren Sie vorsichtig die Gel-Sandwich aus dem Gerät und entfernen Sie alle Klammern von den Glasplatten. Um das Gel von den Platten zu entfernen, drücken einer der Abstandshalter zur Seite der Platten, und drehen Sie sie vorsichtig nach oben zu ziehen und sich die obere Glasplatte. Fassen Sie zwei Ecken des Gels und heben Sie sie vorsichtig, um es aus dem Glas zu entfernen. Das Kieselgel wird in einem geeigneten Behälter mit der gewünschten Nukleinsäuren Färbelösung30-45 min unter Rühren. Nach der Färbung Das Gel wird auf einem Durchleuchtungsbildgebungssystems in der Gel-System erkennen Nukleinsäuren Fluoreszenzsignal.

Representative Results

1 zeigt ein repräsentatives Ergebnis des Nucleocapsid Annealing Mediated Electrophoresis (NAME) Assay, i) durchgeführt mit dem rekombinanten Volllängen-Protein, ii) ohne das Protein, dh das Mischen CTAR + TAR und Inkubation bis zu 1 h bei RT, und iii ) das gleiche Assay mit (12-55) NC, ein synthetisches Peptid, ohne die 11 Aminosäuren der N-terminalen Domäne durchgeführt wird. Die vorgefalteten TAR und CTAR wurden vermischt und die Bildung des Heteroduplex geglüht TAR / CTAR wurde in Gegenwart des rekombinanten Volllängen-NC (linken Spuren von Figur 1) überwacht wird, in der Abwesenheit von Protein (Mittelstreifen in Figur 1 ), und in Gegenwart des trunkierten (12-55) NC Peptid (rechten Fahrspuren in Abbildung 1). Die Bedienelemente sind: gefaltet CTAR, gefaltet TAR und geglüht Hybrid (TAR / CTAR), durch thermische Denaturierung der stabil gefaltete Strukturen TAR zu CTAR gefolgt von ihrer langsamen annealin erhalteng. 14 Die Fähigkeit von NC zwei stabile Nukleinsäuresequenzen in dem erweiterten Hetero Helix denaturiert ist klar ersichtlich: die Volllängen-NC-Protein führt sofort zur Bildung der TAR / CTAR hybrid: 0 'gibt die minimale Zeit, die zwischen Zugabe der NC Die Proben und die Zugabe von Gel-Beladungspuffer, der die Reaktion zum Stillstand kommt; vollständige Ausbildung bereits nach 15 'Inkubationszeit erreicht. Die Zunahme in der Intensität des geglühten Hetero Parallelen der Abnahme der Intensität der gefalteten CTAR und TAR Oligonukleotide. Der Heteroduplexbildung ist auch in Gegenwart der verkürzten Form erreicht, das heißt die (12-55) NC, bestätigt die biologische Aktivität des synthetischen Peptids. In Abwesenheit des Proteins oder des Peptids, die Heteroduplexbildung wird nicht beobachtet, und TAR und CTAR Oligonukleotide wird bei Raumtemperatur nicht in den Heteroduplex (Figur 1) zu tempern. InAlle Versuche, die schnelle Bildung von instabilen Zwischenprodukten ("intermediate complexes" in Figur 1), die mit der Zeit ab beobachtet wird, im Einklang mit dem von den Strangaustausch durch die Haarnadeln CTAR und TAR bis die korrekte Nukleinsäuren Klapp vorgeschlagenen Mechanismus. 17 Eine mögliche Fehlersuche des Experiments ist das Fehlen von SDS im Gelladepuffer. In Abwesenheit von SDS in dem GLB das Ergebnis der Reaktion ist in Figur 2 gezeigt und im Vergleich zu den Ergebnissen mit GLB + SDS. Die vorgefalteten TAR und CTAR wurden gemischt und 3 h bei RT inkubiert, der für 3 Stunden bei 37 ° C mit dem rekombinanten Volllängen-NC-Protein. Ohne SDS (GLB) zur Hälfte Gel-Ladepuffer zugegeben, während auf die andere Hälfte GLB wurde mit SDS (GLB SDS): Nach der Inkubation wurden die Proben in zwei Teile gespalten. Die Proben wurden auf das Gel geladen, und die Position der Nukleinsäuren Banden wurde nach dem Gel laufen visualisiertFarbstoff-Färbung. Wenn NC vorhanden war, aber die Proben mit GLB geladen wurden alle Nukleinsäuren Bands nach oben verschoben: es wird erwartet und zeigt eine starke Bindung zwischen dem Protein und Nukleinsäuren. Die Ergebnisse mit GLB SDS sind in der äußersten rechten Seite des Gels gezeigt: die Zugabe von SDS denaturiert das Protein und gibt die Nukleinsäuren von der stabilen Komplexes mit dem Protein, so dass der Vergleich mit den Kontrollen. Das NAME-Assay wird verwendet, um die Fähigkeit der Gewinde Interkalatoren stabilisieren dynamischen Nukleinsäurestrukturen und hemmen NC Chaperon-Aktivität zu bewerten. 14 Threading Interkalatoren sind planaren aromatischen Moleküle mit sperrigen Seitenketten, die an den gegenüberliegenden Seiten des Ringsystems befinden, wie zum Beispiel Anthrachinon-substituiert in 3A gezeigt. 18 Diese Interkalatoren Lage sind, durch die Doppelhelix der Nukleinsäuren Faden schließlich Lokalisierung ihrer Seitenketten in jeder Nut des DoppelHelix. 19,20 3B zeigt das Ergebnis der BEZEICHNUNG Assay in Anwesenheit von Verbindung 1 eine bekannte Gewinde Interkalator, 18 in der Gegenwart von voller Länge NC oder des verkürzten Peptids. In beiden Fällen wird die Bildung des TAR / CTAR Hybrids durch NC durch Erhöhung der Konzentration der Interkalator, während zur gleichen Zeit die Menge des freien TAR und CTAR zunimmt reduziert. Die verkürzte Form des Protein ohne das N-terminale Schwanz (12-55NC) ist empfindlich gegenüber der Hemmung seiner Aktivität: Diese Differenz wurde mit allen bisher getesteten Verbindungen zu überprüfen. Das NAME-Assay kann auf zwei Arten, entweder durch Vorinkubation der Testverbindung mit NC, gefolgt von der Zugabe der gefalteten Oligonukleotide (NC-Vorinkubation Modus) oder durch Vorinkubation der Testverbindung 15 Minuten lang mit der gefalteten Nucleinsäure Substraten durchgeführt werden , gefolgt von der Zugabe von NC und einer weiteren Inkubation von 15 min (oligo-preincubation Modus). Obwohl die allgemeine Inkubationszeit ist die gleiche in den zwei verschiedenen Betriebsarten, die Vorinkubation mit den gefalteten Oligonukleotide vor der Zugabe des NC ermöglicht mehr Zeit für das Einfädeln der Interkalatoren in den gefalteten Nucleinsäure. Dies führt zu einer stärkeren Stabilisierung ihrer dynamischen Strukturen und in eine leichter Hemmung NC Chaperon-Aktivitäten. Die Analyse des NAME-Assay in den beiden Betriebsarten verbessert daher Unterschiede in der Wirkungsmechanismus von NC-Inhibitoren, wie in Figur 4 gezeigt: Bei Verbindung 1 wurde mit Namen in der Oligo-Vorinkubation Modus analysiert (Abbildung 4, Spuren auf der linken Seite) es zeigt eine starke Hemmung der NC-vermittelte Annealing, während viel niedrigere Inhibierung wird in der NC-Vorinkubation Modus beobachtet (Abbildung 4, Spuren auf der rechten Seite). Beachten Sie, dass für die Bestimmung von Hemmkonzentrationen beim Screenen Gruppen von verwandten Verbindungen mit diesem Assay und unter diesen Bedingungen jeweils Erfahment muss mindestens in dreifacher Ausführung mit eng beieinander liegenden Konzentrationen (vor allem rund um den IC 50 -Wert) 14 durchgeführt werden. Abb. 1: Name Assay mit voller Länge und mit dem NC abgeschnitten (12-55) NC Gefaltete TAR und CTAR, je 1 uM, wurden mit rekombinantem NC oder inkubiert (12-55) NC (Oligos / NC = 1 / 8) 0 min, 15 min, 30 min und 1 Stunde. TAR und CTAR in Abwesenheit von Protein (0 min, 15 min, 30 min und 1 h) inkubiert wurden als negative Kontrolle verwendet. Gefaltete TAR, gefaltet CTAR und der Hybrid TAR / CTAR erhalten nach der thermischen Denaturierung, gefolgt von in vitro Glühen wurden als Kontrollen verwendet. Die Reaktionen wurden dann unter Verwendung GLB SDS gestoppt. Die Proben wurden auf einem 12% Polyacrylamidgel in TBE 1x gelöst; nach der Elektrophorese von Nukleinsäuren auf dem Gel wurden gefärbt und auf einem Transilluminator erkannt. Abb. 2: Wirkung von SDS in Gelladepuffer (GLB) bei der Analyse von TAR / CTAR Glühen von NC TAR und CTAR, in TNMG 1x vorgefaltet, wurden mit rekombinanten Volllängen-NC (Oligos / NC = 1/8) während 3 inkubiert h bei Raumtemperatur oder bei 37 ° C. GLB oder GLB SDS wurden dann auf die Proben mit NC inkubiert. Kontrollen: TAR, CTAR und geglüht Hybrid TAR / CTAR (je 1 uM). Elektrophorese wurde unter Verwendung eines 12% igen Polyacrylamid-Gel in TBE 1x; nach der Elektrophorese von Nukleinsäuren auf dem Gel wurden gefärbt und auf einem Transilluminator erkannt. Diese Zahl hat sich von der Abbildung S4 verändert wurden. Sosic, A. et al Design, Synthese und biologische Bewertung der TAR und CTAR Bindemittel wie HIV-1 Nukleokapsid Inhibitoren MedChemComm 4, 1388 bis 1393, doi:. 10,1039 / c3md00212h (2013) . "> Figur 3: (A) Chemische Struktur des Gewindes Interkalator 1. (B) Wirkung von Gewinde Interkalator 1 durch BEZEICHNUNG Test bewertet. Gefaltete TAR und CTAR, je 1 uM, wurden in Gegenwart der angegebenen Konzentrationen der Verbindung 1 mit dem Volllängen-NC oder mit (12-55) NC inkubiert, jeweils 8 & mgr; M. Gefaltete TAR, gefaltete CTAR und die erweiterte Hetero TAR / CTAR wurden als Kontrollen verwendet. Die Reaktionen wurden dann unter Verwendung GLB SDS gestoppt. Die Proben wurden auf einem 12% Polyacrylamidgel in TBE 1x gelöst; nach der Elektrophorese von Nukleinsäuren auf dem Gel wurden gefärbt und auf einem Transilluminator erkannt. Abbildung 4: Oligo-Vorinkubation gegen NC-Vorinkubation Modi: Auswirkungen auf die Name-Assay Oligo-Vorinkubation mod.e. gefaltet TAR und gefaltet CTAR, je 1 & mgr; M wurden mit den angegebenen Konzentrationen des Gewindes Interkalator 1 für 15 min für weitere 15 min in Gegenwart von vollständiger Länge NC (8 uM) NC-Vorinkubation vorinkubiert und anschließend Modus: die angegebenen Konzentrationen des Gewindes Interkalator 1 wurden mit der vollen Länge NC (8 & mgr; M) für 15 min für zusätzliche 15 min in Gegenwart von gefalteten TAR vorinkubiert und dann gefaltet CTAR, je 1 uM. Gefaltete TAR, gefaltete CTAR und die erweiterte Hetero TAR / CTAR wurden als Kontrollen verwendet. Alle Reaktionen wurden schließlich unter Verwendung GLB SDS gestoppt. Die Proben wurden auf einem 12% Polyacrylamidgel in TBE 1x gelöst; nach der Elektrophorese von Nukleinsäuren auf dem Gel wurden gefärbt und auf einem Transilluminator erkannt.

Discussion

Name ist ein Test, um zeitnah die Inhibierung der Chaperon-Aktivität des Zellkernprotein von HIV-1, ein interessantes Ziel bei der Suche von neuen anti-HIV-Medikamenten ermöglicht. NC lagert sich schnell und bei Raumtemperatur Nukleinsäuren, deren stabile Klapp sonst erfordern thermische Denaturierung bei hoher Temperatur gefolgt von sorgfältiger Glühen. Der Test kann entweder mit voller Länge oder NC mit dem trunkierten (12-55) NC geführt werden: in beiden Fällen werden die zwei Nukleinsäuren (RNA und seinem komplementären DNA-Kopie) rasch getempert. Dies steht im Einklang mit der Literatur Beobachtung mit dem trunkierten NC Peptid: Glühen wird durch die effiziente Schmelzen des Schaftes CTAR gefolgt von Interaktion der komplementären apikalen Schleife, die eine schwache NC-Bindungsstelle initiiert, wobei die komplementäre Sequenz TAR apikalen Schleife, durch mehrere instabile Zwischenprodukte zum erweiterten geglüht Hybrid landen. 21

NC ist eine sehr stabile protEin und einige Probleme bei der Ausführung Name könnte auftreten. Es ist sehr wichtig, aber zu frisch zubereiteten SDS im Gelladepuffer verwendet werden, um die Reaktion zu stoppen hinzu: wenn dies nicht möglich ist, wird das Gel die Nukleinsäurebanden an den richtigen Positionen nicht zu zeigen. In der Tat ist ein NC Nukleinsäure-Bindeprotein, so dass vollständig TAR / CTAR Hetero Visualisierung mittels Gelelektrophorese SDS muss im Gelladepuffer, um das Protein zu denaturieren, und geben sie aus ihrem festen Komplex mit den Nukleinsäuren vorliegen. Dies ist auch eine mögliche Fehlersuche des Versuchs, dh die Bildung der verschobenen Bänder während des Gellaufs. Dieser Effekt wird besonders deutlich, wenn die volle Länge NC wurde eingesetzt, wie in 2, und ist mit der Gegenwart von stark basischen N-terminalen Schwanz verknüpft sind, mit einer starken aggregierende Wirkung auf Nukleinsäuren.

Die Anwesenheit der Klemme Grund Schwanz macht die Annealingreaktion schwieriger, gehemmt werden, so zeigenn in Figur 3 unter Verwendung der Verbindung 1, ein Vertreter Einfädeln Interkalator, dh ein Interkalator besonders effizient bei der Stabilisierung der Stamm-Schleifen-Strukturen und der TAR CTAR. In der Tat ist diese Art der Wechselwirkung mit Nukleinsäuren begünstigt, wenn Wölbungen und Schleifen unterbrechen die Doppelhelix Kontinuität und zum leichteren Einfädeln der sperrigen Substituenten in den Basenpaaren. Stabilisierung von Teer und CTAR durch diese Nukleinsäure Bindemittel zuvor durch die Bestimmung der Erhöhung der Schmelztemperatur der beiden Oligonukleotide analysiert. 14. Darüber hinaus ist die Erhöhung der Schmelztemperatur korreliert mit der Inhibition des Glühens von HIV-1-NC-katalysierte was zur verminderten Bildung des Heteroduplex-TAR / CTAR und anzeigt, dass das Einfädeln Interkalatoren sind eine interessante Klasse von Bindemitteln für dynamische Strukturen RNA wie das TAR-Element. 14

Der Wirkmechanismus aufgerufen, für diese Kompounds kann durch Durchführen der BEZEICHNUNG Assay in verschiedenen alternativen Formen validiert werden, wie in Figur 4 dargestellt: im Fall von Interkalatoren die Hemmung geglüht Heteroduplex wird verstärkt, wenn der Wirkstoff mit den zwei gefalteten Oligos inkubiert. Verbindungen mit anderen Wirkmechanismus, wie etwa Gleich Bindemittel der NC-Protein wirkt, würde durch die verschiedenen Vorinkubation Modus weniger beeinträchtigt. BEZEICHNUNG Assay in den beiden Verfahren könnte daher verwendet werden, um Bibliotheken von Verbindungen zur Identifizierung von NC-Inhibitoren screenen geführt, und auch die mutmaßlichen Wirkungsmechanismus von den positiven Treffern zu bewerten, während die Suche nach anti-HIV-Medikamenten bei NC abgezielt. Offensichtlich ist die Verwendung allein dieser Techniken bei der Beanspruchung für einen bestimmten Wirkungsmechanismus fest NC-Inhibitoren nicht ausreichend ist, und andere geeignete biochemische Tests benötigt, um die Arbeitshypothese zu stützen. 14

Schließlich muss betont werden, dass Name verwendet hochgereinigten Enzyme, entweder rekombinante oder synthetische, geben wertvolle Informationen über die "in vitro" Hemmung der NC durch die getesteten Verbindungen. Dies ist die "Stärken und Schwächen" des Tests: NAME gut ergänzen virtuelles Screening und molekularer Modellierungsansätze in den Vorstufen der Wirkstoffforschung und ermöglicht die schnelle Entwicklung und Analyse von Struktur-Wirkungsbeziehungen und schließlich Neuausrichtung der Synthese und Entwicklung von Arzneimitteln. Jedoch, wie andere biochemische Assays in der Medikamentenentwicklung Projekte in HIV verwendet, NAME wird nicht geben Informationen über die Auswirkungen von mutmaßlichen Inhibitoren in Virus-infizierten Zellen.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by Ministero degli Affari Esteri (MAE, DRPG, Unità per la cooperazione scientifica e tecnologica, Grant: PGR Italy-USA) and by MIUR, Progetti di Ricerca di Interesse Nazionale (Grant: 2010W2KM5L_006).

Materials

Name of Material/Equipment Company Catalog Number Comments/Description
cTAR, 29-mer DNA oligo. Desalted. HPLC purified. Metabion International AG Store the stock  solution at -20 °C 
TAR, 29-mer RNA oligo. Desalted. HPLC purified.   Metabion International AG Store the stock aliquot at -80 °C 
(12-55)NC peptide EspiKem srl Store the stock solution at -20 °C
1.5 mL tubes Eppendorf 0030 120 086 Autoclave before use
0.5 mL tubes Eppendorf 0030 121 023 Autoclave before use
Biosphere Filter Tips 0.1-10 µL Sarstedt 701,130,210
Biosphere Filter Tips 2-20 µL Sarstedt 70,760,213
Biosphere Filter Tips 200 µL Sarstedt 70,760,213
Syringe Filter 0,22 µm Biosigma srl 51,798
Ethanol Carlo Erba 414631
Sodium Dodecyl Sulfate Sigma-Aldrich 71725-50G
Dimethyl Sulfoxide Sigma-Aldrich D8418-1L
Sodium Chloride Sigma-Aldrich 71376-1KG
Boric Acid Sigma-Aldrich B0252-2.5KG
Ethylenediaminetetraacetic Acid Sigma-Aldrich E5134-500G
Magnesium Perchlorate Sigma-Aldrich 222283-100G Store the 1M solution at       -20°C
Glycerol Sigma-Aldrich 49770-1L
Bromophenol Blue GE Healthcare Life Sciences 17-1329-01
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine Sigma-Aldrich T9281-100ML
Ammonium Persulfate Sigma-Aldrich A7460-500G Prepare the 10% solution freshly before use
Acrylamide-bis ready-to-use solution 40% (19:1) Merck Millipore 1006401000 Polyacrylamide is highly neurotoxic: wear gloves during the gel casting
Tris ultrapure Applichem A1086,1000
DEPC-treated water Ambion AM9922
Centrifuge 5415R Eppendorf 22,621,408
NanoDrop 1000 spectrometer Thermo Scientific
UV-VIS spectrometer Lambda 20 Perkin Elmer
Protean II xi Cell Bio-Rad 165-1803
PowerPac Basic Power Supply Bio-Rad 164-5050
SybrGreen II RNA Gel Staining Lonza 50523 Make the 1/10000 dilution in TBE 1X. Store it in the dark at 4°C for two weeks 
Geliance 600 Imaging System Perkin Elmer
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References

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Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) AssayHIV-1 Nucleocapsid Protein (NC)RNA/DNA FoldingAntiviral Drug DevelopmentNC Chaperone Activity InhibitionThreading IntercalatorPAGE Analysis

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Sosic, A., Cappellini, M., Scalabrin, M., Gatto, B. Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors. J. Vis. Exp. (95), e52474, doi:10.3791/52474 (2015).
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