JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Nucleocapsid Tavlama Dolayımlı Elektroforez (ADI) Testi HIV-1 Nükieokapsit inhibitörlerinin Hızlı tanımlanması sağlar

Published: January 19, 2015
doi:
10.3791/52474
, , ,
1Department of Pharmaceutical and Pharmacological Sciences,University of Padova, 2The RNA Institute,SUNY Albany

Summary

This protocol describes NAME, an assay that allows the rapid identification of molecules able to inhibit in vitro the chaperone activities of HIV-1 nucleocapsid protein.

Abstract

RNA ya da kararlı üç boyutlu katlanmasına katlanmış bir DNA antitümör ya da antiviral ilaçların geliştirilmesinde ilginç hedeflerdir. HIV-1 durumunda, virüs aktivitesinin düzenlenmesinde rol oynayan viral proteinler birçok nükleik asitleri tanır. nükleokapsid protein NCp7 (NC) virüs replikasyonu sırasında birkaç süreçleri düzenleyen önemli bir proteindir. NC aslında RNA ve DNA ve tavlama kolaylaştırılması ikincil yapıları istikrarsızlaştırıcı bir şaperonudur. NC inaktivasyonu yeni bir yaklaşım, anti-HIV tedavisi için bir ilgi çekici bir hedeftir. K bir nnealing- M D lectrophoresis ediated ucleocapsid (ADI) deneyi ile, örneğin TAR saç tokası yapıları ve HIV cTAR elemanları olarak termodinamik olarak kararlı üç boyutlu konformasyon katlanmış RNA ve DNA erime ve tavlama önleyebilen moleküller tanımlamak amacıyla geliştirilmiştir HIV-1 nükleokapsid protein. Yeni tahlil yeniden ya istihdamönceki etiketleme gerek kalmadan birleşmesini veya sentetik protein, ve oligonükleotitler. Sonuçların analizi konvansiyonel nükleik asit boyaması ile standart poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) ile elde edilir. Bu çalışmada rapor edilen protokol nükleik yetkin hem asit şaperonlar tam uzunluktaki bir protein ya da bazik N-terminal eksik olan kesilmiş sürümüyle ADI analizini gerçekleştirmek için ve nasıl NC şaperon aktivitesinin inhibisyonunu değerlendirmek için açıklamaktadır enterkalatörün parçacığı. Ayrıca, AD teşhis Kuzey Carolina inhibitörlerinin etki mekanizması, farazi ilgili bilgiler elde etmek için, iki farklı yararlı gerçekleştirilebilir.

Introduction

insan bağışıklık eksikliği virüsü tip 1 (HIV-1) nükleokapsid protein NCp7 (NC) ters transkripsiyon sırasında bir kofaktör olarak virüs çoğalmasında önemli bir rol oynuyor sıkıca olgun bulaşıcı virüsün genomik RNA ile ilişkili olan, küçük, bazik protein, bir genom tanıma ve ambalaj. 1-3 NC istikrarlı nükleik asit yapılarının istikrarsızlaştırma ve tamamlayıcı dizilerin tavlanmasını katalize bir nükleik asit hastabakıcı olarak görev yapar. Çift yönlü destabilize edici aktivitesi çinko parmak yapıları (12-55 peptid) eşlenmiş ise onun nükleik asit toplayıcı aktivitesi 11 amino asit temel olarak N-terminal bulunur. 4, pozitif yüklü bir protein bağlanma reaksiyonunun elektrostatik bariyer düşürür ve İki ayrı tamamlayıcı dizileri bir araya gelip hızını artırır.

Kararlı bir şekle katlanmış nükleik asitler facilitat için NC hastabakıcı faaliyetlerini gerektirirE bunların tavlama 5 Bu NC şerit aktarma olayları çok önemlidir ters transkripsiyon, özellikle önemlidir:. eksi ip aktarımı giderildi, eksi ip durdurma DNA gibi retrotranscribed R bölgesinde, bir tamamlayıcı diziye aktarılan ve tavlanmış olmalıdır termodinamik olarak tercih edilen olmakla birlikte, RNA genomunun 3 'ucunda şablonu. 6, bu reaksiyon sonucu R bölgelerinde trans-aktivasyon duyarlı bölgesi (TAR), RNA ve kararlı bir yapının varlığı NC yokluğunda geniş bir oluşmaz bu da, DNA kopyası (cTAR DNA). karakteristik sap-halka yapısındaki 7 cTAR ve TAR, aslında, yüksek düzeyde yapılanmış olan bölgeler ile ilişkili olmalıdır. Kuzey Carolina proteini, bu toka denatüre, ve tamamlayıcı nükleik asit iplikçikleri arasındaki moleküller arası tavlama hızını arttırarak eksi-kordonlu transferini teşvik eder. TAR ve cTAR NC tavlama mekanizması iyice incelenmiş ve de olmuşturçeşitli araştırma kağıtları TAR tavlama deneyi olarak tarif ve önerilen şema mükemmel değerlendirmeleri tasvir edilir. 8-11 Özetleme, NC, böyle TAR-RNA gibi kararlı RNA ikincil yapısını destabilizes onun tamamlayıcı dizisi, cTAR-DNA ikincil yapısını destabilizes ve bir sonucu olarak tavlama katran / cTAR hetero oluşumuna yol açan bir RNA / DNA tepki. 10,11 teşvik, HIV replikasyonu esnasında şerit transfer adımı tercih edilir. 12

NC doğru küçük moleküllerin neden olduğu olası parazit tehlikeye NC aktivitesinin bir sonucu olarak, viral genomun ters transkripsiyon bir azalma ile sonuçlanır çünkü yeni antiviral ajanların geliştirilmesi için çekici bir hedeftir. 2,13 Bu yaklaşım olabilir sonuçta başarılı bir anti-HIV maddelerinin geliştirilmesine yol açar. NC için bir tarama sırasında biz de bilinen özelliklerine dayanarak bir tahlil geliştirdi 14 inhibitörleriverimli istikrarsızlaştırmak için nükleokapsit ve tavlama tamamlayıcı oligonükleotidlerden. 10,11 Biz N A nnealing- M E lectrophoresis (ADI) deneyi ediated ucleocapsid çağırdı. ADI deney hibrid katran / cTAR heterodubleksin vermek üzere, tamamlayıcı DNA dizisinin (cTAR) ile TAR RNA sekansının üst kısmı karşılık gelen oligonükleotid bizim durumumuzda, tamamlayıcı nükleik asitlerin stabil bir şekilde yapılandırılmış kopyalar arasında tavlama aracılık NC kullanır . NC mevcudiyetinde katran / cTAR bağlanma reaksiyonu analizi yerli poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) ile araştırılabilir.

Bu protokol, hızla stabil saç tokası yapıları katlanmış oda sıcaklığı oligonükleotidlerle de tavlanmasına için ADI tahlil gerçekleştirmek için nasıl gösterir, nasıl deney reaksiyonu ve olası arıza sonucu analiz etmek. Nükleik asidin Radyoaktif etiketleme talep ve duyurma değiloligonükleotid bantlarının konvansiyonel boyama yöntemleri ile yapılabilir. rekombinant tam uzunluktaki protein veya NC kesik bir sentetik versiyonu ya da kullanan deney, NC, RNA ve DNA ile kuvvetli bir bağlanma ile ilişkili olduğu gösterilmiştir bir inhibe edici aktiviteye diş ara katkılar belirlenmesini sağlar. 14.

Protocol

Malzeme, Nükleik Asitler ve Proteinler 1. Hazırlık Nükleik Asitler 1.5 ml tüpler Otoklav ve steril bir kap içinde depolamak. Kirletici maddeleri laboratuvar sarf gelen nükleazlar yani ortadan kaldırmak için steril filtre ipuçlarını kullanarak her adımı gerçekleştirin. DEPC ile muamele edilmiş su içinde Tris-HCI, 10 mM tampon pH 7.5 hazırlamak ve bir 0.22 um gözenek boyutlu filtre içinden filtre edilirken çözelti filtre. NOT: "TAR" olarak adlandırılan oligonükleotid kısa (29-mer) RNA dizisine karşılık 5'-GGCAGAUCUGAGCCUGGGAGCUCUCUGCC-3 '15 cTAR kendi DNA tamamlayıcı dizisi 5'-GGCAGAGAGCTCCCAGGCTCAGATCTGCC-3 iken'. Yukarıda belirtilen Tris tamponu TAR ve cTAR hem çözünür (1.1.2.) 100 mcM stok çözümleri yapmak. -20 ° C'de saklayın cTAR stok çözeltisi (alikotları bu koşullarda ay depolanabilir). RNA uzun süreli depolama için, TAR 20 ul hacimde yapmakStok çözeltisi, bir vakum yoğunlaştırıcı santrifüj kullanılarak, her bir kısım kurutulur ve -80 ° C'de saklayın. Taze, kullanımdan önce, 20 ul DEPC ile muamele edilmiş su içinde her bir TAR kısım tekrar süspansiyon. Not: Çalışma TAR alikotları, iki hafta boyunca -20 ° C'de muhafaza edilebilir. NC proteini ve (12-55) NC peptit Rapor edilen tam boyunda biraraya getiren NC proteini hazırlanır. 16 mağazası -20 ° C 'de parçalar halinde stok çözeltisi. 6410 M -1 cm-1, 280 nm 'de bir sönüm katsayısı kullanarak, bir UV-Vis ile tam protein konsantrasyonunu belirleyin. Sentetik (12-55) Tris-HCI, 10 mM pH 7.5 içinde Carolina peptid yeniden süspanse edilir ve -20 ° C'de parçalar halinde stok solüsyonu saklayın. 5,700 M, 280 nm 'de bir sönüm katsayısı kullanarak, bir UV-Vis doğru peptid konsantrasyonunu belirlemek 1 cm-1. Not: (12-55) NC Peptit HPLC saflaştırıldı ve liyofilize elde edildiÇinko klorür iki eşdeğer ihtiva eden bir çözelti üzerinden ilized. Bileşik 1 Bir analitik terazi kullanılarak liyofilize bileşik 1 yaklaşık 1 mg tartılır ve yüksek bir konsantrasyon (≈10 mM) stok çözeltisi elde etmek üzere,% 100 DMSO içinde 100 ul, vaktinde tartılır içinde çözülür. Onun sönüm katsayısı kullanılarak UV-Vis spektrofotometre üzerinde tam bileşik konsantrasyonunu belirlemek (354 nm: 11.387 M -1 cm -1). Kullanımdan önce -20 ° C'de karanlıkta stok solüsyonu saklayın. 2. Gel Gel cihaz ve Döküm kurma Kuru onlara izin,% 70 etanol ile (uzun diğeri kısa) iki tabak durulama, jel kurmak, ve sonra daha uzun plaka uzun kenarları boyunca iki 1 mm pulları yerleştirmek için; Kısa plaka ile örtün, ve altta iki tabak hizalamak için emin olun. Jel dökme için, SUPP tarafından sağlanan yönergeleri izleyinlier (sandviç kelepçeler ve yığınlar her döküm aparatı tarafından sağlanan farklı tedarikçiler biraz farklı cihazı kullanın). Tüm durumlarda, kelepçeler, yığınlar ve contalar temiz olduğundan emin olun, önceki kullanıcılar tarafından sol akrilamid izlerini kaldırmak. Döküm standı monte jel sandviç yerleştirin ve tedarikçi tarafından özel talimatları uygulayın. NOT: Genellikle döküm yuvasının altındaki temiz bir silikon conta iyi bir sızdırmazlık sağlar ve jel dökerken sızıntıları önlemek için yardımcı olur. Cam plakalar arasında bir pipet kullanarak damıtılmış su dökün, kaçakları kontrol etmek. Sandviç doldurmak ve hiçbir sızıntıları emin olmak için birkaç dakika bekleyin su ekleyin. Sandviç doğru monte edilirse, suyun ayrılması ve gözlük kurumaya iki gözlük arasındaki bir filtre kağıdı yerleştirin. Kağıdı çıkarın ve şimdi sandviç jel döküm için hazırdır. Oda sıcaklığında (RT, 25 ° C) 'de jel dökün. Poliakrilamid derece nörotoksik olduğundan, eldiven giyin. Bizeolmayan denatüre (yerli) koşullarda e sürekli% 12 poliakrilamid jeller ADI tahlil gerçekleştirmek için. % 12 jel çözeltisi hazırlayın:% 40 akrilamid 12 ml karıştırın / bisakrilamid (19/1) çözümü, 4 ml TBE 10x tampon (10x: Tris-HCl 890 mM, Borat 890 mM EDTA 20 mM) ve 24 ml MilliQ su . 400 ul APS ve kullanımdan hemen önce Temed 50 ul ekleyin. Çözüm karıştırın ve hızla cam plakalar arasındaki çözüm aşağı dökmek bir pipet kullanın. Kabarcıklar kaçınarak, cam plakalar arasındaki tarağı tanıtın. Tam sandviç doldurmak için jel solüsyonu ekleyin. Jel, 1 saat 45 dakika süreyle polimerize olsun. Hemen örnek yüklemeden önce, yavaş yavaş tarak çıkarın ve distile su ile iyice durulayın kuyu. Polimerizasyon ve kuyular durulama adımlarından sonra, dikey jel elektroforezi için aparat jel sandviç yerleştirmek için tedarikçi tarafından özel talimatları uygulayın. Bir soğutma sistemi varsa, cor jel sistemini yerleştirmek için emin olunSoğutma çekirdeğin ru konumu. Sistem birden fazla jel işlemek için tasarlanmış, ama sadece bir jel çalıştırmak zorundadır ise, tam üst tampon odasına oluşturmak üzere diğer tarafta soğutma çekirdek tampon baraj gibi bir jel sandviç takın. NOT: Baraj doğru yerleştirilir değilse, üst tampon jel çalıştırmak durdurma muhtemelen sızdırıyor. (: Tris-HCl 89 mM, borat 89 mM, EDTA 2 mM 1x), iyonu giderilmiş su içinde çalışan tampon TBE 2.5 L hazırlayın. Üst tampon odası için TBE tamponu ayrı yaklaşık 500 ml Set ve alt tampon odasına geri kalanını dökün. Üst tampon odasına kalan 500 ml TBE tampon dökün. Anot ve katot uygun pozisyonda böylece, alt tampon odasının üstüne kapağını yerleştirin. Varsa hortumları kullanarak bir su musluğuna, soğutma çekirdek bağlayın. Elektroforez sırasında bir ısı alıcı olarak hareket ve musluk suyu seçecek sırasında çekirdek aracılığıyla dolaşıma izin verir musluk suyu ile çekirdek, Dolgurophoresis. 3. Nükieokapsit Tavlama aracılı Elektroforez (ADI) Deneyi Tamponlar hazırlanması TNMg tamponu hazırlayın (1x: Tris-HCI 10 mM, NaCI, 20 mM Mg (ClO 4) 2 1 mM, pH 7.5), DEPC ile muamele edilmiş su ve 0,22 um gözenek boyutlu filtre içinden filtre edilirken çözelti filtre. Not: TNMg tampon 7 güne kadar 4 ° C 'de muhafaza edilebilir. En iyi katlama ve tavlama sonuçları için, taze yapılmış tamponlar kullanılmasını tavsiye ederiz. SDS ihtiva eden bir jel yükleme tamponu hazırlayın (glb SDS: Tris-HCl, 100 mM EDTA, 4 mM, 50% w / h gliserol,% 2 w / hac SDS,% 0.05 mavi h bromofenol / ağ), DEPC ile muamele edilmiş su içinde. NOT: GLB oligonükleotidler örnekleri jel sistemine çalışan ne kadar izlemek için yardımcı olur ve jel içine örnekleri batmaya sağlar. GLB için SDS eklenmesi ADI tahlil optimal başarısı için kritik bir adımdır. Bu adımı takip değilse, o ge nükleik asitler bant ayırt etmek mümkün değildirl sistemi (Şekil 2). Hazırlık Kontrolleri Seri oligonükleotidler stok çözümleri sulandırmak ve TAR 1 uM çözeltisinin 10 ul hazırlamak için taze yapılmış 10 mcM çözümler kullanabilirsiniz. Ayrı ayrı, aynı şekilde hazırlayın 1 uM cTAR 10 ul TNMg 1x tamponu içinde. 5 dakika boyunca 95 ° C'ye kadar, her tüp ısıtılması ve daha sonra da kök çıkıntı-döngü yapılarını varsaymak TAR ve cTAR sırayla oda sıcaklığına soğumaya bırakın. Kontrol olarak hibrid TAR / cTAR 1 uM çözeltisi hazırlayın. 10 ul bir toplam hacim içinde, TNMg 1x 10 uM cTAR 1 ul 10 uM TAR 1 ul karıştırın. 5 dakika boyunca 95 ° C'ye değin ısıtılması ile oligonükleotitleri denatüre ve bırakmak TAR, tamamlayıcı dizi cTAR tavlanacak şekilde ve çift-şeritli hibrid katran / cTAR oluşturmak için sırayla oda sıcaklığına yavaş yavaş soğumaya bırakılmıştır. Çözeltiler, oda sıcaklığına kadar soğutuldu, zaman, bir kısa-eğirme santrifüj uygulayın. GLB SDS 3 ul ekleyin, pipet EACh tüpü 3 kez içinde çözüm ve buz tüpü koymak. Yükleme adım kadar buz üzerinde sabit kontrol örnekleri tutun. Numuneler hazırlık NC protein ve (12-55) NC peptit aktivitesini analiz etmek Her bir numune için taze 4 uM oligonükleotid çözeltisi 2.5 ul kullanın. Her zaman pipetleme hataları önlemek için her çözümün biraz aşırı miktarda hazırlamak. Yukarıda belirtilen kontroller hazırlanması için bildirilen TNMg 1x tamponu içinde cTAR bölgesinin ayrı ayrı, TAR 4 mcM solüsyonu 32.5 ul katlayın ve (adım 3.2.1.). MilliQ su ile 80 uM çözeltisine, her iki NC Stok protein çözeltisi ve (12-55) NC peptit seyreltin. TAR, cTAR çözeltiler, oda sıcaklığına kadar soğutulur, her iki tüp kısa-eğirme santrifüj yapmak ve numuneler boruların hazırlanması başlar. Tüpler otoklava 12 boş 0.5 ml hazırlayın. Laboratuar örnekleri için rafa 4 tüp 3 satır yerleştirin. Her satır th analiz sırasıyla örnekleri gösterire tam uzunlukta NC proteini, protein olmadan örnekleri ve numuneler (12-55) NC peptit aktivitesini analiz etmek. Her zaman farklı reaktif kullanılan ipuçları değiştirin. Her bir tüp haline TAR 2.5 ul ve katlanmış cTAR 2.5 ul ekleyin. NC ve (12-55) NC analizi için numuneler 4 ul DEPC arıtılmış su ekleyin. Diğer örnekler 5 ul DEPC arıtılmış su ekleyin. Sırasıyla, Örneklerin 80 mcM NC 1 ul veya 80 uM (12-55) 1 ul NC ekle, NC veya (12-55) NC analizi. Her boru 3 kez içinde solüsyonu pipetle, (Şekil 1 'de "0 olarak rapor) saat 0 dakika örnekleri glb SDS hemen 3 ul ekleyin ve son olarak buz üzerine tüp koydu. Tüm örnekler ve kontroller için bu adımı tekrarlayın. Yükleme adım kadar buz üzerinde sabit örnekleri tutun. 15 dakika, 30 dakika ve oda sıcaklığında inkübasyondan 1 saat sonra, glb SDS 3 ul EAC içindeki çözeltisi pipeth tüpü 3 kez ve buz tüpü koymak. Sırasıyla tüm örnekler ve kontroller için bu adımı yineleyin ve yükleme aşamasına kadar buz üzerinde tutmak. Jel cihazının kapağını çıkarın. Yük kuyulara her numunenin 13 ul daha önce iyi oluşturan tarak ile jel döküm tarif Oluşan. Şekil 1'de bildirilen düzeni aşağıdaki örnekleri yükleyin. Jel cihazının kapağını değiştirin. Güç kaynağına jel cihazının açar takın. Elektrotlar güç kaynağı doğru yuvalara takılı olduğundan emin olun. Güç açma ve Renk verici madde jelin alt yukarıda 1.5 cm göç kadar, 2 saat boyunca karıştırılır ve 200 V sabit gerilimde, 30 dakika boyunca jel üzerinde çalıştırıldı. Numune hazırlama NC ve (12-55) NC üzerinde antrakinon etkinliğini analiz etmek Bileşik 1 stok solüsyonu sulandırmak. 500 uM, 10 ul, 250 uM, bileşik 50 uM, 5 uM seyreltme hazırlanması <MiliQ suyu 1 strong>. Yukarıda belirtildiği gibi, kontrol örnekleri hazırlayın (paragraf 3.2.). Her bir numune için taze 4 uM oligonükleotid çözeltisi 2.5 ul kullanın. Her zaman pipetleme hataları önlemek için her çözümün biraz aşırı miktarda hazırlamak. TNMg 1x tamponunda cTAR bölgesinin ayrı ayrı, TAR 4 mcM çözeltisi 27.5 ul katlayın ve yukarıdaki gibi (adım 3.2.1.) Sözü. Su içinde 80 uM çözeltisine, her iki NC Stok protein çözeltisi ve (12-55) NC peptit seyreltin. TAR ve cTAR çözümleri oda sıcaklığına soğutuldu zaman, her iki tüpler kısa spin santrifüj gerçekleştirmek ve numunelerin hazırlanması başlar. Tüpler otoklava 20 boş 0.5 ml hazırlayın. Laboratuar örnekleri için rafa 10 tüplerin her biri 2 satır yerleştirin. Her zaman farklı reaktif kullanılan ipuçları değiştirin. Katlanmış TAR 2.5 ul ilk sıranın her tüp ekleyin. Katlanmış cTAR 2.5 ul ikinci sıranın her tüp ekleyin. <li> Uygun bileşik 2 ul ekleyin 1 seyreltme TAR ve cTAR (500 uM seyreltme için 5 uM konsantrasyonu artar). Bileşiğin olmaması durumunda NC analizi ve (12-55) NC örneklerde, bileşiğin su ile değiştirin. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin. 15 dakika inkübasyondan sonra, muhabir TAR örneklerinde (birinci sıranın tüpleri) ile cTAR örnekleri (ikinci sıranın tüpler) karıştırın. Sırasıyla, NC veya (12-55) NC analizi için numuneler 80 mcM NC 1 ul veya 80 uM (12-55) 1 ul NC ekleyin. 15 dakika inkübasyondan sonra, GLB SDS 3 ul eklediğiniz her tüpü 3 kez pipet ve buz tüpü koymak. NC ve (12-55) NC analizi için numuneler kullanılarak, sırasıyla, bu adımı tekrarlayın. Yükleme adım kadar buz üzerinde sabit örnekleri tutun. Jel cihazının kapağını çıkarın. Kuyulara her numunenin 13 ul yükleyin. Şekil bildirilen sırayla aşağıdaki örnekleri yükleyinure 3B. Jel cihazının kapağını değiştirin. Güç kaynağına jel cihazının açar takın. Elektrotlar güç kaynağı doğru yuvalara takılı olduğundan emin olun. Güç açma ve Renk verici madde jelin alt yukarıda 1.5 cm göç kadar, 2 saat boyunca karıştırılır ve 200 V sabit gerilimde, 30 dakika boyunca jel üzerinde çalıştırıldı. Numune hazırlama: NC-preinkübasyon modu vs Oligo-preinkübasyon modu Bileşik seyreltin 1 stok solüsyonu. 500 uM, 10 ul, 250 uM, 50 uM, MiliQ suyu içinde bileşik 1 5 uM seyreltme hazırlayın. Yukarıda belirtildiği gibi, kontrol örnekleri hazırlayın (paragraf 3.2.). Her bir örnek için 4 uM oligonükleotid çözeltisi 2.5 ul kullanın. Her zaman pipetleme hataları önlemek için her çözümün biraz aşırı miktarda hazırlamak. Yukarıda belirtildiği gibi TNMg 1x tamponu içinde cTAR bölgesinin ayrı ayrı, TAR 4 mcM çözeltisi 27.5 ul katlayın ve (adım 3.20,1.). Su içinde 80 uM çözeltisine, her iki NC Stok protein çözeltisi ve (12-55) NC peptit seyreltin. TAR ve cTAR çözümleri oda sıcaklığına soğutuldu zaman, her iki tüpler kısa spin santrifüj gerçekleştirmek ve numunelerin hazırlanması başlar. Her zaman, her zaman reaktifler değiştirilir ipuçları değiştirmek veya reaksiyon tüpünde bulunan diğer herhangi bir sıvı veya çözelti dokunulursa. Bu aşamada açıkça etiket ve iki farklı ön-kuluçka prosedürleri için örnekleri ayırmak için emin olun. Oligo preinkübasyon modu Tüpler otoklava 10 boş 0.5 ml hazırlayın. Laboratuar örnekleri için rafa 5 tüplerin 2 satır yerleştirin. Katlanmış TAR ilk satırı 2.5 ul her tüp ekleyin. Katlanmış cTAR ikinci sıra 2.5 ul her tüp ekleyin. Uygun bileşik 2 ul ekle 1 seyreltme TAR ve cTAR (500 uM seyreltme için 5 uM konsantrasyonu artar).Bileşiğin olmaması durumunda NC analizi için numune su ile bileşik değiştirin. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin. 15 dakika inkübasyondan sonra, cTAR örnekleri (ikinci sıra) almak ve muhabir TAR örneklerinde (ilk satır) ile koyun. Her bir numune için 80 uM NC 1 ul ilave edin ve oda sıcaklığında 15 dakika için örnek inkübe edin. 15 dakika inkübasyondan sonra, GLB SDS 3 ul eklediğiniz her tüpü 3 kez pipet ve buz tüpü koymak. Yükleme adım kadar buz üzerinde sabit örnekleri tutun. NC-preinkübasyon modu 5 boş 0.5 mL otoklava tüpleri hazırlayın ve laboratuar örnekleri için rafa koyun. Uygun bileşik 1 seyreltme her tüp 4 ul ekle (500 uM seyreltme için 5 uM konsantrasyonu artar). Bileşiğin olmaması durumunda NC analizi için numune su ile bileşik değiştirin. 80 μ her bir tüp içinde ekleme 1 ulM, Kuzey Carolina, oda sıcaklığında 15 dakika için örnek inkübasyon ve. Bir tüp haline cTAR 15 ul katlanmış TAR 15 ul karıştırın ve bir sonraki aşamada bu TAR + cTAR solüsyonu kullanın. 15 dakika inkübasyondan sonra, TAR + cTAR karışımı çözeltisi her bir örnek, 5 ul ekle ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca numune inkübe edin. 15 dakika inkübasyondan sonra, GLB SDS 3 ul eklediğiniz her tüpü 3 kez pipet ve buz tüpü koymak. Yükleme adım kadar buz üzerinde sabit örnekleri tutun. NOT: aşama ile ilgili 3.5.8 yapılan analizler tüm örneklerde (3.5.7 den devam) ile yapılabilir. Jel cihazının kapağını çıkarın. Kuyulara her numunenin 13 ul yükleyin. Şekil 4 bildirilen düzeni aşağıdaki örnekleri yükleyin. Jel cihazının kapağını değiştirin. Güç kaynağına jel cihazının açar takın. Elektrotlar güç Özel Sayı doğru yuvalara takılı olduğundan emin oluny. Güç açma ve Renk verici madde jelin alt yukarıda 1.5 cm göç kadar, 2 saat boyunca karıştırılır ve 200 V sabit gerilimde, 30 dakika boyunca jel üzerinde çalıştırıldı. 4. Jel ve Jel Boyama Çıkarma Elektroforez sonrasında, güç kaynağını kapatın ve elektrik kablolarını sökün. Soğutma sisteminin su musluğunu kapatın ve çekirdek hortumları ayırın. Sistem soğutuldu eğer, soğutma çekirdek kaldırmak ve her iki odalarından tampon kapalı dökün, kapağını kaldırın ve. Yavaşça cihazdan jel sandviç sökmeye ve cam plakalar tüm kelepçeleri çıkartın. , Plakalardan jel kaldırmak plakaların yan dışarı aralama birini itmek ve yukarı çekin ve uzak üst cam levha için yavaşça çevirin. Jel iki köşe kavrayın ve camdan çıkarmak için hafifçe kaldırın. Için arzu edilen nükleik asitler, boyama çözeltisi ile uygun bir kapta jel yerleştirinKarıştırılarak 30-45 dk. Boyama işleminden sonra jel sisteminde nükleik asitler, floresan sinyalini tespit etmek için bir transilluminator'de görüntüleme sisteminde jel koydu.

Representative Results

Şekil 1, tam uzunluktaki rekombinant protein, ile) yapılır, Nükieokapsit Tavlama Aracılı Elektroforez (ADI) deneyi temsil eden bir sonucunu göstermektedir ii) cTAR + TAR karıştırılması ve oda sıcaklığında 1 saat kadar kuluçkalanması, yani protein, ve iii olmadan ) (12-55) NC, N-terminal alanının 11 amino asit eksiği olan bir sentetik peptid ile gerçekleştirilen aynı deney. Şekil 1 'de daha önceden katlanmış TAR, cTAR karıştırılmış ve tavlanmış hetero TAR oluşumu / cTAR proteininin yokluğunda (Şekil 1' in sol şerit) tam boyunda biraraya getiren NC mevcudiyetinde gözlenmiş (merkezi kuşak ) ve Şekil 1 'de kesik (12-55) NC peptit (sağ şerit varlığında). Kontroller vardır: onların yavaş annealin ardından cTAR için TAR stabil katlanmış yapıların termal denatürasyon yoluyla elde edilen, cTAR katlanmış TAR katlanmış ve hibrit (TAR / cTAR) tavıörn. 14 uzatılmış hetero sarmal içinde iki sabit nükleik asit dizilerini denatüre etmek için NC kabiliyeti net bir şekilde belirgindir: tam uzunlukta NC proteini katran / cTAR hibridin oluşturulmasına hemen yol açar: 0 'NC ilave arasından geçen en az bir zaman işaret örnekler ve reaksiyon durur jel yükleme tamponu eklenmesi; Tam oluşumunun başladığı 15 'inkübasyon süresi sonunda elde edilir. tavlanmış heterodubleksin yoğunluğundaki artış katlanmış cTAR ve TAR oligonükleotidlerin yoğunluğundaki azalma ile paralellik göstermektedir. hetero oluşumu, tepe bölümü kesik bir halinin varlığı altında da elde sentetik peptidin biyolojik aktivitesini teyit (12-55) NC yani edilir. Protein ya da hetero oluşumu gözlenmez peptidin, katran ve cTAR oligonükleotid yokluğunda heterodubleksin içine oda sıcaklığında (Şekil 1) bağlandığı bir olmaz. IçindeTüm deneyler, kararsız ara ürünler zamanla azalır (Şekil 1 "ara kompleksleri") hızlı oluşumu sürekli doğru nükleik asitler katlama kadar cTAR ve TOKALAR ve TAR yoluyla iplik değişimi önerilen mekanizma ile, görülmektedir. 17 Deney olası bir sorun Jel Yükleme Tamponu SDS eksikliğidir. GLB SDS yokluğunda reaksiyon sonucu, Şekil 2'de gösterilen ve glb + SDS ile sonuç ile karşılaştırılır. Katlanmış TAR, cTAR karıştırılır ve oda sıcaklığında 3 saat süreyle inkübe edildi ve yeniden birleştirici tam uzunlukta NC proteini ile 37 ° C de 3 saat karıştırıldı. SDS (GLB olmadan) bir yarım jel yükleme tampon maddesi ile, diğer yarısına glb SDS (glb SDS) ile ise, ilave edildi: Kuluçkadan sonra, örnekler iki ayrılmıştır. Örnekler jel üzerine yüklendi ve nükleik asitler, bantların konumu tarafından işletilen jel sonra görselleştirilmiştirboya boyama. Bu beklenen ve protein ve nükleik asitler arasında güçlü bir bağlanma gösterir: NC mevcut ama örnekler GLB yüklü edildiğinde, tüm nükleik asitler bantları kadar kaymıştır. glb SDS ile sonuçlar jel aşırı sağ gösterilmiştir: SDS ilavesi, kontroller ile karşılaştırma yapılmasına olanak tanıyan, protein denatüre ve protein ile kararlı bir kompleks nükleik asitleri serbest bırakmaktadır. ADI deney dinamik nükleik asit yapılarını dengelemek ve NC şaperon aktivitesini inhibe arasında ara diş kabiliyetini değerlendirmek için kullanılır. 14 Diş ara katkılar örneğin antrakinon gibi halka sisteminin karşıt bölgelerde yer alan büyük yan zincirler ile ikame edilmiş düzlemsel aromatik moleküllerdir Şekil 3A'da gösterilen. 18 Bu ara katkılar nükleik asitlerin çift sarmal aracılığıyla iplik mümkün, son olarak çift her oluğa yan zincirleri yerinisarmaldan oluşur. 19,20 Şekil 3B, tam uzunlukta NC mevcudiyetinde ya da tepe bölümü kesik peptit 1 numaralı bileşik ile, bilinen bir diş ara katkı, 18 mevcudiyetinde ADI tahlilinin sonuçlarını göstermektedir. Her iki durumda da, NC tarafından katran / cTAR hibrid oluşumu sırasında, aynı zamanda, serbest TAR ve cTAR miktarı artar interkalatörünün konsantrasyonunun arttırılması ile azaltılır. N-terminal kuyruğu (12-55NC) eksik proteininin tepesi kesik bir şekli onun etkinliğinin engellenmesi için daha duyarlıdır: bu fark kadar test edilen bütün bileşikler ile doğrulandı. ADI deneyi, ya da katlanmış bir nükleik asit alt-tabakalar ile, 15 dakika boyunca test bileşiği ön enkübasyona tabi tutulması ile iki yolla, ya da katlanmış oligonükleotidlerin (NC-preinkübasyon modu) ilave edildi NC ile test bileşiği, önceden inkübe edilerek yapılabilir , NC ilavesi ve 15 dakika (oligo PR için bir başka inkübasyon takipeincubation modu). Genel inkübasyon süresi iki farklı modlarda aynı olmasına rağmen, NC eklenmesinden önce katlanmış oligonükleotitlerle preinkübasyon katlanmış nükleik asidin içine enterkalatörleri bir parçacığı için daha fazla zaman sağlar. Bu dinamik yapılarının güçlü istikrar ve NC hastabakıcı faaliyetlerinin daha kolay bir inhibisyonu içine sonuçlanır. Şekil 4'te gösterildiği gibi, iki modda ADI deneyinin analizi, bu nedenle, Kuzey Carolina inhibitörlerinin etki mekanizması farklılıkları geliştirir: bileşik 1 oligo preinkübasyon modunda NAME ile analiz edildiğinde (Şekil 4, sol şerit) çok daha düşük inhibisyon NC-preinkübasyon modunda görülmektedir oysa, NC-aracılı tavlama güçlü engellenmesini göstermektedir (Şekil 4, sağda şerit). Bu deneyde ve bu koşullarda, her deney içinde ilgili bileşikler arasından kümelerini tarama sırasında inhibe edici konsantrasyonlarının belirlenmesi için lütfen unutmayınment, üçlü (özellikle IC50 değeri civarında), yakın aralıklı konsantrasyonu kullanılarak en azından gerçekleştirilmelidir. 14 Şekil 1:. Tam uzunlukta NC ve kesilmiş (12-55) NC Kırımlı TAR ve cTAR, her 1 mcM ile ADI tahlil, rekombinant NC ile ya da inkübe edildi (12-55) NC (oligolar / NC = 1 / 8) 0 dakika, 15 dakika, 30 dakika ve 1 saat karıştırıldı. Protein (0 dakika, 15 dakika, 30 dakika ve 1 saat) yokluğunda inkübe TAR, cTAR negatif kontrol olarak kullanılmıştır. Katlanmış TAR katlanmış cTAR ve hibrid katran / cTAR in vitro bağlanma kontrol olarak kullanıldı ve ardından ısı denatürasyonundan sonra elde edilmiştir. reaksiyonlar sonra GLB SDS kullanılarak durduruldu. Numuneler TBE 1x% 12 poliakrilamid jel üzerinde çözüldü; jeli üzerinde elektroforez nükleik asitler sonra lekeli bir transilluminator'de ile tespit edildi. Şekil 2:. TAR analiz ederken, jel yükleme tampon maddesi SDS Etkisi (glb) / TNMg 1x önceden katlanmış Carolina TAR ve cTAR, tarafından cTAR tavlama tam boyunda biraraya getiren NC (oligo / NC = 1/8) 3 ile kuluçkaya yatırılmıştır Oda sıcaklığında veya 37 ° C 'de sa. Glb veya glb SDS sonra NC ile kuluçkalanmış numunelere ilave edildi. Kontroller: TAR, cTAR ve tavlanmış hibrid TAR / cTAR (her biri 1 uM). Elektroforez TBE 1x% 12 poliakrilamid jel kullanılarak yapıldı; jeli üzerinde elektroforez nükleik asitler sonra lekeli bir transilluminator'de ile tespit edildi. Bu şekil, Şekil S4 modifiye edilmiştir:. Sosic, A. ve diğerleri tasarımı, sentezi ve HIV-1 nükleokapsid inhibitörleri olarak TAR ve cTAR bağlayıcı biyolojik değerlendirmesi MedChemComm 4, 1388-1393, DOI:. / C3md00212h (2013) 10,1039 . "> Şekil 3: ADI testi ile değerlendirildi enterkalatörün 1 diş ve diş ara katkı 1. (B) (A) Kimyasal yapısı Etkisi. TAR ve cTAR, her biri 1 uM Katlanmış, her biri 8 uM tam uzunlukta NC ya da (12-55) NC ile bileşik 1 belirtilmiş konsantrasyonlarının varlığında inkübe edildi. CTAR ve genişletilmiş hetero TAR katlanmış Katlanmış TAR / cTAR kontroller olarak kullanılmıştır. reaksiyonlar sonra GLB SDS kullanılarak durduruldu. Numuneler TBE 1x% 12 poliakrilamid jel üzerinde çözüldü; jeli üzerinde elektroforez nükleik asitler sonra lekeli bir transilluminator'de ile tespit edildi. Şekil 4: NC-preinkübasyon modları Oligo-preinkübasyon: ADI tahlil üzerindeki etkileri Oligo-preinkübasyon mod.E:., katlanmış TAR, cTAR katlanmış her biri 1 uM, tam uzunlukta NC (8 uM), NC-kuluçka öncesi mevcudiyetinde 15 dakika daha sonra, 15 dakika boyunca diş enterkalatörün 1 belirtilen konsantrasyonları ile önceden inkübe edildi ve modu: diş enterkalatörün 1, belirtilen konsantrasyonlar, 15 dakika boyunca tam uzunlukta NC (8 uM) ile ön inkübasyona tabi ve daha sonra ilave 15 dakika boyunca katlanmış TAR mevcudiyetinde ve cTAR, her biri 1 uM katlanmış. CTAR ve genişletilmiş hetero TAR katlanmış Katlanmış TAR / cTAR kontroller olarak kullanılmıştır. Tüm reaksiyonlar sonunda GLB SDS kullanılarak durduruldu. Numuneler TBE 1x% 12 poliakrilamid jel üzerinde çözüldü; jeli üzerinde elektroforez nükleik asitler sonra lekeli bir transilluminator'de ile tespit edildi.

Discussion

ADI hızla HIV-1, yeni anti-HIV ilaçlarının arayışında olan bir ilginç hedef nükleokapsid protein şaperon aktivitesinin inhibisyonunu değerlendirmek için izin veren bir deneydir. NC hızlı ve kararlı olan katlama aksi dikkatli tavlama ardından yüksek sıcaklıkta termal denatürasyon gerektirecek oda sıcaklığı nükleik asitler de tavlanan. Deney iki tam uzunlukta NC ya da kesik (12-55) NC ile gerçekleştirilebilir: her iki durumda da, iki nükleik asitler (RNA ve onun tamamlayıcı DNA kopyası) hızlı bir şekilde tavlanır. Bu tepe bölümü kesik Kuzey Carolina peptidi ile literatür gözlemiyle tutarlıdır tavlama TAR apikal döngünün tamamlayıcı dizisi ile, zayıf bir Kuzey Carolina bağlanma yeri onun tamamlayıcı apikal döngünün ilişkiler üzerinde cTAR gövdesinin etkin bir şekilde eritme ile başlatılır, genişletilmiş tavlı hibrid birkaç kararsız ara ürünler ile biten. 21

NC çok kararlı bir prot olduğunuein ve birkaç sorun performans ADI oluşabilir ise. Bu sağlanamadığı takdirde, jel doğru pozisyonlarda nükleik asit bantları göstermez: Ancak Tampon reaksiyonu durdurmak için kullanılan Jel Yükleniyor taze yapılmış SDS eklemek için çok önemlidir. Bu proteini doğru bir şekilde denatüre ve nükleik asit ile sıkı kompleks serbest bırakmak için bir jel yükleme tamponu içinde mevcut olması gerekir jel elektroforezi SDS katran / cTAR heterodubleksin görselleştirmek için çok Aslında, Kuzey Carolina, bir nükleik asit bağlayıcı bir proteindir. Bu da jel çalışması sırasında kaymıştır bantların oluşumu, yani deney olası bir sorun giderme, olduğunu. Bu etki tam uzunluktaki NC Şekil 2'deki gibi, kullanılan zaman özellikle belirgin olup, nükleik asitlerin üzerinde güçlü bir etkiye sahip olan agregasyon, yüksek oranda bazik N-terminal ucunun varlığına bağlıdır.

Terminal temel kuyruk varlığı gösterisi olarak, tavlama reaksiyonu daha zor inhibe yaparn Şekil 3 kullanılarak bileşik 1, bir temsilci diş ara katkı, TAR ve cTAR kök-döngü yapılarını stabilize özellikle verimli, yani bir ara katkı olarak. Aslında, nükleik asitler ile bu etkileşim çıkıntı ve döngüler baz çifti şeklindeki kütleli ikame daha kolay bir iş parçacığı sağlayan, çift sarmal sürekliliğinin kesintiye zaman tercih edilir. Bu nükleik asit bağlayıcı ile TAR ve cTAR stabilizasyonu daha önceleri, iki oligonükleotid erime sıcaklığı artış belirlenmesi ile analiz edilmiştir. 14 Ayrıca, erime sıcaklığı artışı, HIV-1 NC tarafından katalize edilen tavlama inhibisyonu ile bağlantılı olmasına karşın, hetero katran / cTAR oluşumunun yol ve diş ara katkılar örneğin TAR elemanı olarak RNA dinamik yapılar için bağlayıcıların ilginç bir sınıfı olduğuna işaret etmektedir. 14.

Etki mekanizması, bu kaçakları için çağrılırŞekil 4'te gösterildiği gibi unds Ayrıca, farklı alternatif biçimlerde ADI tahlili yapılarak geçerli olabilir: araya durumunda tavlanmış heterodubleksin inhibisyonu geliştirilmiş ilaç katlanmış iki oligo ile inkübe edildiği zaman. Böyle NC proteinin doğrudan bağlayıcı olarak farklı etki mekanizması ile hareket eden bileşikler, farklı preinkübasyon modu daha az etkilenen olacaktır. ADI tahlil bu nedenle, Kuzey Carolina inhibitörlerinin belirlenmesi için bileşiklerin kütüphaneleri taramak için kullanılabilir iki yöntem uygulanır, ve NC hedefleyen anti-HIV ilaçlarının ararken pozitif isabet etki farazi mekanizmanın belirlenmesi. Açıktır ki, tespit Kuzey Carolina inhibitörlerinin spesifik bir eylem mekanizması için iddia tek başına bu tekniklerin kullanımı yeterli değildir ve başka uygun deneyler, biyokimyasal çalışma hipotezi sürdürmek için ihtiyaç vardır. 14

Son olarak, bu ADI yüksek kullandığı vurguladı gerekirTest edilen bileşimler NC "in vitro" engellenmesi değerli bilgi veren yeniden birleştirici ya da sentetik ya da saflaştırılmış enzimler. Bu "güç ve zayıflık" testinin ise: ADI iyi sanal tarama tamamlayabilir ve moleküler modelleme hızla yapı-aktivite ilişkileri kurmak ve analiz sağlayan ve sonunda sentez ve ilaç tasarımı yönlendirerek, ilaç keşif programlarının ön adımlarla yaklaşır. Diğer biyokimyasal analizler HIV ilaç geliştirme projelerinde kullanılan Ancak, ADI virüs ile enfekte hücrelerde varsayılan inhibitörlerinin etkileri hakkında bilgi vermez.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by Ministero degli Affari Esteri (MAE, DRPG, Unità per la cooperazione scientifica e tecnologica, Grant: PGR Italy-USA) and by MIUR, Progetti di Ricerca di Interesse Nazionale (Grant: 2010W2KM5L_006).

Materials

Name of Material/Equipment Company Catalog Number Comments/Description
cTAR, 29-mer DNA oligo. Desalted. HPLC purified. Metabion International AG Store the stock  solution at -20 °C 
TAR, 29-mer RNA oligo. Desalted. HPLC purified.   Metabion International AG Store the stock aliquot at -80 °C 
(12-55)NC peptide EspiKem srl Store the stock solution at -20 °C
1.5 mL tubes Eppendorf 0030 120 086 Autoclave before use
0.5 mL tubes Eppendorf 0030 121 023 Autoclave before use
Biosphere Filter Tips 0.1-10 µL Sarstedt 701,130,210
Biosphere Filter Tips 2-20 µL Sarstedt 70,760,213
Biosphere Filter Tips 200 µL Sarstedt 70,760,213
Syringe Filter 0,22 µm Biosigma srl 51,798
Ethanol Carlo Erba 414631
Sodium Dodecyl Sulfate Sigma-Aldrich 71725-50G
Dimethyl Sulfoxide Sigma-Aldrich D8418-1L
Sodium Chloride Sigma-Aldrich 71376-1KG
Boric Acid Sigma-Aldrich B0252-2.5KG
Ethylenediaminetetraacetic Acid Sigma-Aldrich E5134-500G
Magnesium Perchlorate Sigma-Aldrich 222283-100G Store the 1M solution at       -20°C
Glycerol Sigma-Aldrich 49770-1L
Bromophenol Blue GE Healthcare Life Sciences 17-1329-01
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine Sigma-Aldrich T9281-100ML
Ammonium Persulfate Sigma-Aldrich A7460-500G Prepare the 10% solution freshly before use
Acrylamide-bis ready-to-use solution 40% (19:1) Merck Millipore 1006401000 Polyacrylamide is highly neurotoxic: wear gloves during the gel casting
Tris ultrapure Applichem A1086,1000
DEPC-treated water Ambion AM9922
Centrifuge 5415R Eppendorf 22,621,408
NanoDrop 1000 spectrometer Thermo Scientific
UV-VIS spectrometer Lambda 20 Perkin Elmer
Protean II xi Cell Bio-Rad 165-1803
PowerPac Basic Power Supply Bio-Rad 164-5050
SybrGreen II RNA Gel Staining Lonza 50523 Make the 1/10000 dilution in TBE 1X. Store it in the dark at 4°C for two weeks 
Geliance 600 Imaging System Perkin Elmer
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Druillennec, S., et al. A mimic of HIV-1 nucleocapsid protein impairs reverse transcription and displays antiviral activity. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 4886-4891 (1999).
  2. Darlix, J. L., Garrido, J. L., Morellet, N., Mely, Y., de Rocquigny, H. Properties, functions, and drug targeting of the multifunctional nucleocapsid protein of the human immunodeficiency virus. Adv Pharmacol. 55, 299-346 (2007).
  3. Thomas, J. A., Gorelick, R. J. Nucleocapsid protein function in early infection processes. Virus Res. 134, 39-63 (2008).
  4. Mirambeau, G., Lyonnais, S., Gorelick, R. J. Features, processing states, and heterologous protein interactions in the modulation of the retroviral nucleocapsid protein function. RNA Biol. 7, 724-734 (2010).
  5. Zeng, Y., et al. Probing nucleation, reverse annealing, and chaperone function along the reaction path of HIV-1 single-strand transfer. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 12651-12656 (2007).
  6. Basu, V. P., et al. Strand transfer events during HIV-1 reverse transcription. Virus Res. 134, 19-38 (2008).
  7. Guo, J., Henderson, L. E., Bess, J., Kane, B., Levin, J. G. Human immunodeficiency virus type 1 nucleocapsid protein promotes efficient strand transfer and specific viral DNA synthesis by inhibiting TAR-dependent self-priming from minus-strand strong-stop DNA. J Virol. 71, 5178-5188 (1997).
  8. Godet, J., Mely, Y. Biophysical studies of the nucleic acid chaperone properties of the HIV-1 nucleocapsid protein. RNA Biol. 7, 687-699 (2010).
  9. Darlix, J. L., et al. Flexible nature and specific functions of the HIV-1 nucleocapsid protein. J Mol Biol. 410, 565-581 (2011).
  10. Lapadat-Tapolsky, M., Pernelle, C., Borie, C., Darlix, J. L. Analysis of the nucleic acid annealing activities of nucleocapsid protein from HIV-1. Nucleic Acids Res. 23, 2434-2441 (1995).
  11. Vo, M. -. N., Barany, G., Rouzina, I., Musier-Forsyth, K. Mechanistic studies of mini-TAR RNA/DNA annealing in the absence and presence of HIV-1 nucleocapsid protein. J Mol Biol. 363, 244-261 (2006).
  12. Beltz, H., et al. Structural determinants of HIV-1 nucleocapsid protein for cTAR DNA binding and destabilization, and correlation with inhibition of self-primed DNA synthesis. J Mol Biol. 348, 1113-1126 (2005).
  13. Mori, M., et al. Nucleocapsid Protein: a Desirable Target for Future Therapies against HIV-1. Curr Top Microbiol Immunol. , .
  14. Sosic, A., et al. Design, synthesis and biological evaluation of TAR and cTAR binders as HIV-1 nucleocapsid inhibitors. MedChemComm. 4, 1388-1393 (2013).
  15. Tabarrini, O., et al. Studies of Anti-HIV Transcription Inhibitor Quinolones: Identification of Potent N1-Vinyl Derivatives. Chemmedchem. 5, 1880-1892 (2010).
  16. Hagan, N., Fabris, D. Direct mass spectrometric determination of the stoichiometry and binding affinity of the complexes between nucleocapsid protein and RNA stem-loop hairpins of the HIV-1 Psi-recognition element. Biochemistry. 42, 10736-10745 (2003).
  17. Ivanyi-Nagy, R., Davidovic, L., Khandjian, E. W., Darlix, J. L. Disordered RNA chaperone proteins: from functions to disease. Cell Mol Life Sciences: CMLS. 62, 1409-1417 (2005).
  18. Zagotto, G., et al. Tuning G-quadruplex vs double-stranded DNA recognition in regioisomeric lysyl-peptidyl-anthraquinone conjugates. Bioconjug Chem. 22, 2126-2135 (2011).
  19. Carlson, C. B., Vuyisich, M., Gooch, B. D., Beal, P. A. Preferred RNA binding sites for a threading intercalator revealed by in vitro evolution. Chem Biol. 10, 663-672 (2003).
  20. Gooch, B. D., Beal, P. A. Recognition of duplex RNA by helix-threading peptides. J Am Chem Soc. 126, 10603-10610 (2004).
  21. Kanevsky, I., et al. Structural determinants of TAR RNA-DNA annealing in the absence and presence of HIV-1 nucleocapsid protein. Nucleic Acids Res. 39, 8148-8162 (2011).

Tags

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) AssayHIV-1 Nucleocapsid Protein (NC)RNA/DNA FoldingAntiviral Drug DevelopmentNC Chaperone Activity InhibitionThreading IntercalatorPAGE Analysis

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Sosic, A., Cappellini, M., Scalabrin, M., Gatto, B. Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors. J. Vis. Exp. (95), e52474, doi:10.3791/52474 (2015).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image