核衣壳退火介导电泳（NAME）分析允许HIV-1核衣壳抑制剂的快速鉴定

1.准备材料，核酸和蛋白质核酸高压灭菌1.5 ml微量离心管，并将它们存储在无菌容器中。执行使用无菌过滤嘴，以消除污染物质，即核酸从实验室耗材每一步。 制备的Tris-HCl的10mM缓冲液，pH 7.5在DEPC-处理的水和过滤用0.22μm孔径过滤器的溶液。 注：所谓的“焦油”的寡核苷酸对应于短（29聚体）的RNA序列5'-GGCAGAUCUGAGCCUGGGAGCUCUCUGCC-3'15而CTAR是它的DNA的互补序列5'-GGCAGAGAGCTCCCAGGCTCAGATCTGCC-3'。 在Tris缓冲上述溶解tar和CTAR（1.1.2），使100μM储备液。商店CTAR原液在-20℃（等分可保存几个月在这些条件下）。对于长期储存的RNA，使西藏自治区的20微升等分原液，使用真空浓缩离心机干燥每个等分试样并将其储存在-80℃。新鲜的使用之前，重新悬浮于20μlDEPC处理的水每TAR等分。 注：工作TAR等分可以储存在-20℃下两周。 NC蛋白和（12-55）NC肽制备全长重组的NC蛋白作为报道16储存于-20℃下储备溶液以等分试样。确定使用的消光系数的确切蛋白质浓度使用UV-Vis分光光度计在6410 M -1 -1 280纳米。 重悬合成的（12-55）的NC肽的Tris-HCl 10mM的pH为7.5和原液中的等分试样储存在-20℃。确定使用的消光系数上的紫外可见分光光度计的正确的肽浓度的5700 M 280纳米-1 -1。 注：（12-55）NC肽，获得HPLC纯化和lyophilized出含有两当量的氯化锌的溶液。 化合物1 称重约1mg冻干化合物1的使用分析天平和溶解于100微升的100％DMSO中，巧称重，以得到高浓度（≈10毫摩尔）储液。利用其消光系数确定其每紫外可见分光光度计的确切化合物浓度（在354纳米：11387 M -1厘米-1）。储存在-20℃，使用前将储备溶液在黑暗中。 2.设置凝胶的凝胶设备和铸造了要设置的凝胶，冲洗两个板（一长一短的），用70％的乙醇，让它们干燥，然后放置两个1毫米垫片沿长板的长边;与短板覆盖它，并确保对准两个板块在底部。 投凝胶，遵循人联党提供的说明利尔（不同的供应商使用略有不同的设备;三明治夹和堆栈各铸造装置提供）。在所有情况下，确保夹具，堆栈和垫圈是干净，并去除丙烯酰胺的痕迹由以前的用户留下。 将在铸造支架组装凝胶三明治并按照供应商的具体说明。 注意：一般清洁硅胶垫片在浇铸槽的底部，确保良好的密封，并有助于避免泄漏浇注的凝胶时。 要检查是否有泄漏，使用玻璃板之间的移液管倒入蒸馏水。加水填满三明治，等待几分钟，以确保没有泄漏发生。如果夹心是正确地组装时，除去水，并插入一个滤纸两个玻璃之间以干燥的眼镜。取出纸张，现在夹心准备凝胶浇注。 倾凝胶在室温（RT，25℃）。由于聚丙烯酰胺是高度神经，戴手套。我们在非变性（天然）条件E连拍12％聚丙烯酰胺凝胶进行NAME检测。 准备12％凝胶溶液：混合12毫升40％丙烯酰胺/双丙烯酰胺（19/1）解决方案，4毫升TBE 10x缓冲液（10X：的Tris-HCl 890毫米，890硼酸毫米，EDTA 20毫米）和24毫升超纯水。加入400微升APS和50微升立即使用前TEMED。混合溶液中，并迅速地用一个吸管倒出溶液倒在玻璃板之间。引入梳玻璃板之间，避免气泡。添加凝胶溶液以完全填充夹心。 让凝胶聚合​​45分钟到1小时。马上装样前，慢慢地取出梳子和水井冲洗用蒸馏水彻底。 经过聚合和水井冲洗步骤，请按照供应商的具体说明，将凝胶三明治垂直电泳设备。如果冷却系统存在，请务必将凝胶体系的心病冷却芯的矩形的位置。 如果系统被设计为处理一个以上的凝胶，但只有一个凝胶具有要运行，附加一个凝胶夹层作为缓冲坝至冷却芯的另一侧，以形成完整的上缓冲液槽。 注意：如果大坝放置不正确，上缓冲区将泄漏可能停止运行凝胶。 制备2.5升的TBE的运行缓冲液（1×：Tris-盐酸89毫，硼酸89毫米，EDTA 2毫摩尔）的去离子水。置相距约500毫升的TBE缓冲液用于上缓冲室和倾其余进入下部缓冲室。倒入剩余500毫升TBE缓冲液到上部缓冲室。 放置在下部缓冲室的顶部的盖子，以使阳极和阴极是在适当的位置。 连接冷却芯，如果存在的话，以一个水龙头用软管。填充芯用自来水，将作为电泳期间散热器，并允许通过选在芯自来水循环rophoresis。 3.核衣壳退火介电泳（NAME）分析缓冲区的制备制备TNMG缓冲液（1×：的Tris-HCl的10mM，NaCl的20mM，镁（CLO 4）2 1毫米，pH值7.5）在DEPC-处理的水和过滤用0.22μm孔径过滤器的溶液。 注：TNMG缓冲器可以存储在4℃至7天。为了获得最佳的折叠和退火效果，建议使用新鲜的缓冲区。 制备的凝胶上样缓冲液含有SDS（GLB SDS：Tris-盐酸100mM的，EDTA 4mM的，50％w / v的甘油，2％w / v的SDS，0.05％w / v的溴酚蓝）于DEPC处理过的水。 注：GLB有助于跟踪多远寡核苷酸的样本正在运行到凝胶系统，并允许下沉样品进入凝胶。除SDS至GLB的是NAME的测定法的最佳成功的一个关键步骤。如果没有遵循此步骤中，它不可能区分核酸频带中戈升系统（ 图2）。 控制准备连续稀释的寡核苷酸股票方案，并使用新鲜的10微米的解决方案，以准备10微升的TAR的1微米的解决方案。准备以相同的方式，单独地，将10μl一个1μM的CTAR在TNMG 1X缓冲液中。加热每个管至95℃进行5分钟，然后离开冷却至室温，以便TAR和CTAR承担其茎 – 膨出环结构。 准备1微米的解决方案混合TAR / CTAR作为控制。拌1微升10μM的TAR用1微升10μM的CTAR在TNMG 1X，在10微升的总体积。由管加热至95℃5分钟变性寡核苷酸和离开它缓慢冷却至室温，以便TAR退火至其互补序列CTAR并形成双链杂交TAR / CTAR。 当溶液冷却至室温，进行短旋转离心。加入3微升GLB SDS的，吸管EAC内管3倍H液，并把该管在冰上。请对照样品稳定在冰上，直到加载一步。 样品制备，分析NC蛋白和（12-55）NC肽活性用2.5微升各样品新鲜制备4μM的寡核苷酸溶液中。总是准备每个解决方案有点过量，防止移液错误。在TNMG 1X缓冲折32.5微升的TAR的4微米的解决方案，并单独CTAR作为报告的编制控制上面提到的（步骤3.2.1）。 稀两者的NC蛋白的原液和（12-55）肽的NC至80微米的溶液用milliQ水中。 当TAR和CTAR溶液冷却至RT，执行这两个管的短旋转离心，并开始将样品管的制备。 准备12个空0.5毫升蒸压管。放置3排4管在机架的实验室样品。每行表示，分别来分析个样品ê全长的NC蛋白，没有蛋白质样品和样品分析（12-55）的NC肽活性。 总是随时更换不同的试剂使用技巧。 加入每管2.5微升折叠TAR和2.5微升折叠CTAR的。加入4微升DEPC处理过的水的样本（12-55）NC数控和分析。添加5微升DEPC处理水的其他样品。 加入1μl的80μMNC或1微升的80微米（12-55）的NC的样品，分别为NC或（12-55）的NC分析。 加立即3微升GLB的SDS于时间0分钟的样品（ 图1中报告为0'），移液内每个管3倍溶液中，并且最后把该管在冰上。重复所有样品和对照这一步。保持稳定的样品在冰上，直到加载一步。 后15分钟，30分钟和1小时温育在室温下，加入3微升GLB的SDS，吸管内EAC溶液ħ管3倍，并把该管在冰上。重复所有样品和对照，分别此步骤中，并保持在冰上，直到装载步骤。 取下凝胶装置的盖。负载13微升的每个样品放入孔中形成的通过铸造凝胶具有良好的成形梳如前所述。加载以下报道于图1的顺序中的样品。 取代凝胶装置的盖。附加凝胶装置的引线到电源。检查电极插入到电源中正确的插槽。 打开电源并运行凝胶2小时和30分钟，在200伏的恒定电压，直至染料已迁移至1.5厘米凝胶的底部的上方。 样品制备，分析蒽醌活动的NC和（12-55）NC 稀释的化合物1母液。制备10微升的500微米，250微米，50微米，5微米稀释化合物的<STRONG> 1的超纯水。 准备对照样品上述报告（第3.2段）。 用2.5微升各样品新鲜制备4μM的寡核苷酸溶液中。总是准备每个解决方案有点过量，防止移液错误。在TNMG 1X缓冲倍CTAR 27.5微升的TAR的4微米的解决方案，并分别，如上面提到的（步骤3.2.1）。 稀两者的NC蛋白的原液和（12-55）肽的NC至80微米的解决方案中的水。 当TAR和CTAR溶液冷却至RT，执行这两个管的短旋转离心，并开始样品的制备。 准备20空0.5毫升蒸压管。将2行，每行10管机架的实验室样品。 总是随时更换不同的试剂使用技巧。 加入第一排的每个管2.5微升折叠TAR的。加在第二行的每一个管，用2.5微升折叠CTAR的。 <li>添加2微升合适的化合物 1稀释TAR和CTAR（从5微米到500微米的稀释浓度增加）。样品在更换水化合物的数控的在不存在化合物的分析和（12-55）的NC。孵育样品15分钟，在室温。 孵育15分钟后，混合CTAR样品（第二排的管）与相应的TAR样品（第一行的管）。 加入1μl的80μMNC或1微升80微米（12-55）NC的样品NC或（12-55）NC分析，分别。 孵育15分钟后，加入3微升GLB SDS，和吸取各管3倍，并把该管在冰上。重复这个步骤，分别使用样品为NC和（12-55）的NC分析。保持稳定的样品在冰上，直到加载一步。 取下凝胶装置的盖。装载13微升各样品放入孔中。加载样品下列报道中所示的顺序URE 3B。 取代凝胶装置的盖。附加凝胶装置的引线到电源。检查电极插入到电源中正确的插槽。 打开电源并运行凝胶2小时和30分钟，在200伏的恒定电压，直至染料已迁移至1.5厘米凝胶的底部的上方。 样品制备：低聚预培养模式VS NC-预培养模式淡化复合 1母液。制备10微升的500微米，250微米，50微米，5微米稀释化合物1的milliQ水中。 准备对照样品上述报告（第3.2段）。 用2.5微升4μM的寡核苷酸溶液对每个样品。总是准备每个解决方案有点过量，防止移液错误。在TNMG 1X缓冲折27.5微升的TAR的4微米的解决方案，并单独CTAR作为上述（步骤3.20.1。）。 稀两者的NC蛋白的原液和（12-55）肽的NC至80微米的解决方案中的水。 当TAR和CTAR溶液冷却至RT，执行这两个管的短旋转离心，并开始样品的制备。 总是更换每次试剂被改变的提示，或者如果包含在反应管中的任何其他液体或溶液被触摸。 从这一步骤确保清楚标示并分离样品的两个不同的预孵育步骤。 低聚预培养模式准备10个空0.5毫升蒸压管。将2排5管在机架的实验室样品。 加在第一行2.5微升折叠TAR中的每个管中。加在第二行2.5微升折叠CTAR中的每个管中。 加入2微升合适的化合物 1稀释TAR和CTAR（从5微米到500微米的稀释浓度增加）。样本中替换水复合数控在没有化合物的分析。孵育样品15分钟，在室温。 孵育15分钟后，取CTAR样品（第二行），并把它们与相应的TAR样品（第一行）。 加入1μl的80μM的NC向每个样品孵育样品15分钟，在室温。 孵育15分钟后，加入3微升GLB SDS，和吸取各管3倍，并把该管在冰上。保持稳定的样品在冰上，直到加载一步。 NC-预​​培养模式准备5空0.5毫升高压管，并将其放置在机架的实验室样品。 加在各管4微升的适当化合物1的稀释（增加浓度从5微米到500微米的稀释度）。样本中替换水复合数控在没有化合物的分析。 加在每个管1微升80μ，M的NC孵育样品15分钟，在室温。 混合15微升折叠的TAR用15微升折叠CTAR中的管，并使用在下一步此TAR + CTAR溶液。 孵育15分钟后，添加到每个样品取5μlTAR + CTAR混合溶液的孵育样品15分钟，在室温。 孵育15分钟后，加入3微升GLB SDS，和吸取各管3倍，并把该管在冰上。保持稳定的样品在冰上，直到加载一步。 注意：从步骤3.5.8上分析可以与所有样本（来自3.5.7恢复）进行。 取下凝胶装置的盖。装载13微升各样品放入孔中。加载以下报告于图4的顺序采样。 取代凝胶装置的盖。附加凝胶装置的引线到电源。检查电极插入到电源增刊正确的插槽年。 打开电源并运行凝胶2小时和30分钟，在200伏的恒定电压，直至染料已迁移至1.5厘米凝胶的底部的上方。 4.取出凝胶和凝胶染色电泳后，关闭电源，并拔下电器导线。关闭冷却系统的水龙头，并从核心拔下软管。 去掉盖子，并且，如果将系统冷却，取出冷却芯和倒出从两个腔室的缓冲液中。 轻轻拆开从装置凝胶夹层和从玻璃板上除去所有夹子。以从板除去凝胶，推衬垫出到所述板的一侧的一个和扭转它轻轻拉起和离开上部玻璃板。抓住凝胶的两个角，然后将其关闭轻轻地从玻璃中删除。 将凝胶在一个合适的容器中与所需的核酸染色溶液30-45分钟，同时搅拌。 染色后，把一个透射成象系统上的凝胶，以检测核酸的荧光信号中的凝胶体系。