Makrophagen-Cholesterin Depletion und Auswirkungen auf die Phagozytose<em> Cryptococcus neoformans</em

Phagozytose ist ein Prozess, durch den extrazellulären Instanzen durch Wirtszellen internalisiert. Es ist eine wichtige Waffe im Arsenal des Immunsystems, gegen Krankheitserreger zu verteidigen, aber der Prozess kann oft von Krankheitserregern unterlaufen werden, um für die Internalisierung und Verbreitung im ganzen Körper ¹ zu ermöglichen. Die Phagozytose wird durch mehrere Signalwege, die im Anhang und Einwirkung über Umlagerungen von Zytoskelett der Wirtszelle führen vermittelt. Professional "Phagocyten können sich auf der Oberfläche des eindringenden Pathogens erkennen und binden an Opsonine zur Anbringung und die Bildung der Lamellipodia, die den Krankheitserreger zu verschlingen und bilden eine phagosome ² zu signalisieren. Unter den so genannten "professionellen" Fresszellen sind Makrophagen. Makrophagen sind hoch spezialisierte Zellen, die durchführen, Schutzfunktionen, die die Suche nach und Beseitigung von Krankheitserregern, die Reparatur beschädigter Gewebe und Vermittlung Entzündung, die meisten schließendiese durch den Vorgang der Phagozytose ^1,2.

Cryptococcus neoformans ist eine Art von pathogenen Hefe, die eine schwere Krankheit wie Kryptokokkose bekannt verursacht. Cryptococcus Sporen werden durch den Host Einatmen und führen zu einer Lungeninfektion, die in der Regel asymptomatisch ist. Es wird vermutet, dass die Exposition ist extrem weit verbreitet; eine Stichprobe von 61 Kindern aus den Pediatric Infectious Diseases Clinic am Bronx-Lebanon Hospital Center stellte fest, dass alle Befragten hatten Antikörper gegen das Cryptococcus Polysaccharid glucuronoxylomannan und andere Studien haben Prävalenz sowohl in humanen Immundefizienz-Virus (HIV) infizierten und infizierten Erwachsenen ^{3 gezeigt, 4.} Alveolarmakrophagen sind in der ersten Zeile als Reaktion auf die Lungeninfektion und in den meisten Fällen erfolgreich klare Erregers. , Bei immungeschwächten Personen (zB HIV und AIDS-Patienten), die Hefe jedoch in der Lage, innerhalb der Makrophagen zu überleben. In diesenFällen können die Makrophagen als Nischen für die Replikation des Pathogens dienen und ihrer Weitergabe an das zentrale Nervensystem (ZNS), wobei die Krankheit tödlich ⁵ erleichtern ^{– 8.} Es wird vermutet, dass Makrophagen sogar die Hefe liefern direkt in die Hirnhäute und hilft, die Hefe, um die Blut-Hirnschranke über die "Trojanisches Pferd" Modell ^3,9 überqueren ^{– 11.} Somit ist es wichtig, den Prozess der Phagozytose und die Faktoren, die es beeinflussen, insbesondere in Kryptokokkeninfektionen verstehen.

Frühere Arbeiten in anderen Erreger-Systeme weisen auf Cholesterin und Lipid Rafts von Cholesterin eine wichtige Rolle bei der Phagozytose ¹² spielen gebildet ^{– 15.} Cholesterin ist die am häufigsten vorkommende Lipidspezies in Säugetierzellen und umfasst 25 – 50% der Säugerzelle Membran ^16. Es wurde festgestellt, um eine Rolle bei der Modulation der BioP spielenhysical Eigenschaften von Membranen durch Veränderung ihrer Steifigkeit ^17. Cholesterin und Sphingolipiden bilden Lipidmikrodomänen innerhalb der Membran als Lipid Rafts bekannt. Lipidflößen gefunden worden, um die Bildung von Caveolae, sowie Bereitstellen einer isolierten Domäne für bestimmte Typen von Signalisierungs ¹⁶ beteiligt ^{– 18.} Aufgrund ihrer geringen Größe, ist es schwierig, Lipidflößen in vivo zu studieren. Ein nützlicher Weg, um die Rolle von Lipidflößen zu untersuchen ist, um ihre Bestandteile zu verändern. Methyl-β-Cyclodextrin (MßCD) ist eine Verbindung, die gefunden wurde, um Cholesterin aus Säugetiermembranen führen und wird häufig verwendet, um die Rolle von Lipidflößen ¹⁸ zu studieren.

In diesem Protokoll wird eine Methode, um Cholesterin aus Wirtszellmembranen abzureichern und Quantifizierung der Wirkung der Abreicherung von der Fähigkeit der Wirtszellen, um C. phagozytieren neoformans in vitro. Dieses Verfahren macht Gebrauch von Zellkultur techniques auf einer immortalisierten Makrophagen-Zelllinie (J774A.1) als Modell für die Infektion. Cholesterinabbau durch Einwirkung MßCD, die einen hydrophoben Kern spezifisch an die Größe von Sterolen hat und in der Lage ist, um als Senke für Cholesterin, um es aus der Membran ¹⁹ zu ziehen handeln bewerkstelligt. Cholesterinabbau wurde quantitativ unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Kits und qualitativ mit einer modifizierten Bligh-Dyer Lipidextraktion, gefolgt von Dünnschichtchromatographie (TLC) ²⁰ gemessen. . ^{23 –} Phagozytose wurde durch Infizieren der Zelllinie mit einer Kultur der opsonisierten Hefe mit einem Cocktail von Interferon-γ und Lipopolysaccharid zur Aktivierung der Makrophagen gemischt gemessen Cryptococcus wurde mit einem glucuronoxylomannan (GXM) Antikörper ²¹ opsonisierten. Färbung und Mikroskopie Experimente zur Sichtbarmachung der Zellen und zur Berechnung der phagozytische Index erlaubt, den Grad der Phagozytose zu beurteilen. Zusammengenommen dieses Protokoll describes eine grundlegende Methode, die die Veränderung der Lipid-Zusammensetzung mit einem physiologischen Prozess integriert.