Macrofagen Cholesterol Uitputting en het effect daarvan op de Fagocytose van<em> Cryptococcus neoformans</em

Fagocytose is een proces waarbij extracellulaire entiteiten worden geïnternaliseerd door gastheercellen. Het is een belangrijk wapen in het arsenaal van het immuunsysteem om te beschermen tegen pathogenen, maar het proces kan vaak worden ondermijnd door pathogenen te zorgen voor internalisatie en verspreidt zich door het lichaam ^1. Fagocytose wordt gemedieerd door verschillende signalering gebeurtenissen die de hechting en afblazen via herschikkingen van het cytoskelet gastheercel. 'Professionele fagocyten kunnen herkennen en binden opsoninen op het oppervlak van de pathogeen te signaleren bevestigen van de vorming van lamellipodia die de pathogeen overspoelen en vormen een phagosome ^2. Onder de zogenaamde 'professionele' fagocyten zijn macrofagen. Macrofagen zijn zeer gespecialiseerde cellen die het uitvoeren van beschermende functies die onder andere het zoeken naar en het elimineren van ziekteverwekkers, het repareren van beschadigde weefsels, en het bemiddelen ontsteking, het grootste deel vandeze door het proces van fagocytose ^1,2.

Cryptococcus neoformans is een species van pathogene gist die een ernstige ziekte bekend als Cryptokokkose veroorzaakt. Cryptococcus sporen worden ingeademd door de gastheer en resulteren in een longinfectie die meestal asymptomatisch. Men denkt dat de blootstelling zeer gangbaar; Een monster van 61 kinderen uit de Pediatric Infectious Diseases Clinic bij het ​​Bronx Lebanon Hospital Center gevonden dat alle ondervraagde antilichamen tegen de cryptococcal polysaccharide glucuronoxylomannan en andere studies hebben aangetoond prevalentie in zowel menselijke immunodeficiëntievirus (HIV) geïnfecteerde en geïnfecteerde volwassenen ^{3, 4.} alveolaire macrofagen zijn de eerste regel van het antwoord op de longinfectie en in de meeste gevallen met succes duidelijk de ziekteverwekker. In immuungecompromitteerde personen (bijvoorbeeld HIV en AIDS patiënten) de gist kan overleven in macrofagen. In dezegevallen kan de macrofagen dienen als een niche voor de replicatie van het pathogeen en kan de verspreiding ervan naar het centrale zenuwstelsel (CZS) wanneer de ziekte wordt fatale ⁵ vergemakkelijken ^{– 8.} Er wordt gedacht dat macrofagen ook de gist kan leveren direct in de hersenvliezen, waardoor de gist de bloedhersenbarrière passeren via de "Trojaans paard" model ^{3,9 – 11.} Het is dus belangrijk om het proces van fagocytose en de factoren die van invloed zijn, vooral in cryptococcal infecties begrijpen.

Vorige werk in andere pathogeen systemen wijzen op cholesterol en rafts gevormd door cholesterol als het hebben een belangrijke rol te spelen in fagocytose ^12-15. Cholesterol is de meest voorkomende soorten lipiden in zoogdiercellen en omvat 25 – 50% van de zoogdiercel membraan ^16. Gevonden een rol spelen bij het moduleren van Biophysical eigenschappen van membranen door het veranderen van hun starheid ^17. Cholesterol en sfingolipiden samen lipiden microdomeinen binnen het membraan bekend als lipide rafts. Lipide rafts zijn gevonden betrokken te zijn bij de vorming van caveolae, alsmede het verschaffen van een geïsoleerd domein voor bepaalde signalering ^16-18. Door hun kleine formaat, is het moeilijk om lipide rafts in in vivo. Een handige manier om de rol van lipide rafts bestuderen is hun bestanddelen veranderen. Methyl-β-cyclodextrine (MβCD) een verbinding die is gevonden om cholesterol afbreken van zoogdieren membranen en wordt vaak gebruikt om de rol van rafts ¹⁸ bestuderen.

In dit protocol presenteren we een methode om cholesterol uit gastcelmembranen afbreken en kwantificeren van het effect van de uitputting van het vermogen van de gastheercellen fagocyteren C. neoformans in vitro. Deze procedure maakt gebruik van celkweek techniqUES op een onsterfelijk macrofaagachtige cellijn (J774A.1) als model voor infectie. Cholesterol depletie werd bewerkstelligd door blootstelling aan MβCD die een hydrofobe kern specifiek de grootte van sterolen heeft en kan fungeren als een gootsteen voor cholesterol te trekken uit het membraan ^19. Cholesterol depletie werd gemeten kwantitatief behulp van een commercieel verkrijgbare kit en kwalitatief toepassing van een gemodificeerde Bligh-Dyer lipide extractie gevolgd door dunnelaagchromatografie (TLC) ^20. . Fagocytose werd gemeten door het infecteren van de cellijn met een cultuur van opsonized gist gemengd met een cocktail van interferon-γ en lipopolysaccharide voor het activeren van macrofagen Cryptococcus werd geopsoniseerd met een glucuronoxylomannan (GXM) antilichaam ^21-23. Kleuring en microscopie experimenten termijn voor visualisatie van de cellen en de berekening van de fagocytose index van de mate van fagocytose beoordelen. Bij elkaar genomen, dit protocol describes een basismethode dat de wijziging van lipide samenstelling met een fysiologisch proces integreert.