Modellierung des Lebenszyklus von Ebola Virus unter Biosafety Level 2 Bedingungen mit Virus-ähnlichen Partikeln, die Tetracistronic Minigenome
Summary
Arbeit mit infektiösen Viren Ebola wird Biosicherheitsstufe 4 Laboratorien beschränkt. Tetracistronic Minigenom-haltigen Replikation und Transkription kompetenten virusähnlichen Partikeln (trVLPs) stellen eine Lebenszyklus-Modellierungssystem, das uns sicher zu modellieren mehrere Infektionszyklen unter Biosicherheitsstufe 2 Bedingungen, die sich ausschließlich auf Ebola-Virus-Komponenten ermöglicht.
Abstract
Ebola-Viren verursachen schwere hämorrhagische Fieber bei Menschen und nicht-menschlichen Primaten, mit Letalität so hoch wie 90%. Es gibt keine zugelassenen Impfstoffe oder spezielle Behandlungen für die Erkrankung, die durch diese Viren verursacht, und die Arbeit mit infektiösen Viren Ebola wird Biosicherheitsstufe 4 Laboratorien beschränkt, die Forschung zu diesen Viren erheblich einschränkt. Lebenszyklus-Modell, Modellierungssysteme der Virus-Lebenszyklus unter Biosicherheitsstufe 2 Bedingungen; Bis vor kurzem sind solche Systeme entweder einzelne Aspekte des Virus-Lebenszyklus, oder eine einzige Infektionszyklus beschränkt. Tetracistronic Minigenome, die von Ebola-Virus nicht-kodierenden Regionen, ein Reporter-Gen bestehen, und drei Ebola-Virus-Gene in der Morphogenese beteiligt, angehende und Eintrag (VP40, GP 1,2 und VP24), kann die Replikation und Transkription verwendet werden -competent Virus-ähnliche Partikel (trVLPs), die diese Minigenome. Diese trVLPs kontinuierlich infizieren Zellen, die das EbolaVirusproteine für die Genom Replikation und Transkription, so dass wir sicher modellieren mehrere Infektionszyklen unter Biosicherheitsstufe 2 Bedingungen verantwortlich. Wichtig ist, dass die viralen Komponenten dieser Systeme ausschließlich durch Ebola-Virus stammt und nicht von anderen Viren (wie zum Beispiel in Systemen mit pseudotypisierten Viren der Fall ist), und VP40, VP24 und GP 1,2 sind in diesem System überexprimiert , wodurch es ideal für die Untersuchung der Morphogenese und angehEintrag, obwohl auch andere Aspekte des Virus-Lebenszyklus, wie Genom-Replikation und-Transkription kann auch mit diesem System modelliert werden. Daher ist die tetracistronic trVLP Assay stellt die umfassendste Lebenszyklus-Modellierungssystem für Ebola-Viren zur Verfügung und hat ein enormes Potenzial für den Einsatz bei der Untersuchung der Biologie von Ebola-Viren in Zukunft. Hier stellen wir Informationen über die Nutzung des Systems, sowie die erwarteten Ergebnisse.
Introduction
Ebola-Viren sind die Erreger einer schweren hämorrhagischen Fieber bei Menschen und nicht-menschlichen Primaten, die mit Letalität von bis zu 90% in der menschlichen Ausbrüche 1. Zwar gab es in den letzten Jahren in die Entwicklung von Impfstoffen sowie spezifische Behandlungen (in 2,3 bewertet) wurden erhebliche Fortschritte erzielt, so werden diese nicht für den menschlichen Gebrauch zugelassen. Ebola-Virus-Partikel haben eine charakteristische fadenartiges Aussehen mit einer Länge von etwa 1 um und einen Durchmesser von 96 bis 98 nm 4. Ein Nukleokapsid bildet den Kern der Viruspartikel und besteht aus 1) dem nicht-segmentierten Einzelstrang-negativen Sense-RNA-Genom, das die 7 Ebolavirus-Gene codiert (Figur 1), 2) das Nucleoprotein NP, die das Genom encapsidates, 3 ) der viralen Polymerase-Komplex, bestehend aus der Polymerase-L und dessen Cofaktor VP35, und 4) die transkriptionelle Aktivator VP30. Darüber hinaus wurde kürzlich gezeigt, dass das Protein VP24 ist mit Nukleokapsid assoziierts 4. Das Nukleokapsid ist von dem Matrixbereich, in dem das Matrix-Protein VP40, die für die Morphogenese und Knospung von Virionen verantwortlich ist, befindet sich umgeben. Viruspartikel werden weiter umhüllt und in diesem Umschlag eingebettet ist die einzige Oberflächenprotein GP 1,2, die Virion Befestigung und Eintrag verantwortlich ist.
Arbeit mit infektiösen Viren Ebola muss in einem Hochsicherheitslabor unter Biosicherheitsstufe (BSL) 4 Bedingungen, die diese Arbeit auf einige wenige Standorte weltweit beschränkt durchgeführt werden. Um die Biologie dieser Viren zu studieren oder neue Therapeutika in BSL2- Bedingungen zu entwickeln, setzen die Forscher entweder auf die Überexpression von rekombinanten Proteinen Ebola-Virus, oder Lebenszyklus-Modellierungssysteme, die beide mit in der Abwesenheit von Infektions Ebola-Virus gearbeitet werden. Rekombinante Expression von Ebola-Virus-Proteine entweder von Expressionsplasmiden oder viralen Vektoren erreicht. Ein Sonderfall dieser Strategie ist dieErzeugung von Virionen oder Virus-ähnliche Partikel auf Basis von anderen Viren als Ebola-Viren (üblicherweise Retroviren oder vesikulären Stomatitis-Virus) in Gegenwart von 1,2 GP rekombinant exprimiert, was zur Erzeugung von pseudotypisierten Partikel, die verwendet werden können, um die Studie Eintrag Prozess der Filoviren und Leinwand für Entry-Inhibitoren 5. Alternativ können rekombinante Viren (zB, vesikuläre Stomatitis-Virus), die das Ebola-Virus GP 1,2 ihrer eigenen Glykoprotein codieren statt erzeugt und verwendet werden, um das Eindringen von Viren unter Biosicherheitsstufe 2 Bedingungen 6 studieren.
Lifecycle Modellierungssysteme sind Formen der reversen Genetik Systeme mit dem Einsatz von Ebola-Virus-Genom abgeschnitten Analoga (Minigenome), der zunächst aus cDNA hergestellt werden und dann repliziert und vom Ebola-Virus-Proteine in trans bereitgestellt transkribiert. Die erste Minigenom-System für Ebola-Virus wurde vor mehr als 15 Jahren entwickelt, 7Und ist seit verwendet worden, um Ebola-Virus-Genom-Replikation und Transkription (in 8,9 bewertet) studieren. In diesem System wird ein monocistronisches Minigenoms aus einer einzigen Reportergens durch das Endgerät nicht-kodierenden Regionen des Ebola-Virus-Genom flankiert (als Leader und Trailer) (Abbildung 1) wird in Säugerzellen (in der Regel durch Transkription mit T7-RNA-Polymerase) exprimiert zusammen mit den viralen Proteinen L, VP35, VP30 und NP. Die Minigenom durch NP eingekapselt und dann repliziert und transkribiert von den anderen Nucleocapsid-Proteine unter Verwendung von cis-wirkenden Signale in dem Leader und Trailer lokalisiert, was zu einer Reporteraktivität, die diese beiden Aspekte des Virus-Lebenszyklus (Figur 2) reflektiert.
Um zusätzliche Schritte des viralen Lebenszyklus, der Transkription und replikationskompetenten Virus-ähnliche Partikel (trVLP) Systeme entwickelt worden, die auf klassischen Minigenom Systeme beruhen Modell, sondern sind mit der einW eitere Ausdruck der anderen viralen Proteine VP24, VP40 und GP 1,2 von Expressionsplasmiden 10,11. Die Anwesenheit von VP40 führt zur Bildung von trVLPs, die GP 1,2 auf ihrer Oberfläche tragen, und führen einen Minigenom enthaltenden Nukleokapsid auf der Innenseite. Diese trVLPs kann verwendet werden, um Zielzellen, die entweder mit Expressionsplasmiden für L, VP35, VP30 und NP pretransfected wurden, zu infizieren, um die Replikation und Transkription des Minigenome in die Zielzellen gebracht innerhalb trVLPs 11 zu erleichtern, oder naiven Zielzellen (dh ohne Plasmid-gesteuerte Expression des Ebola-Virus-Proteine) 10. Dies führt Reporteraktivität in Zielzellen, die die Replikation der Minigenome in den Erzeugerzellen Morphogenese und Knospung trVLPs, deren Eintritt in die Zielzellen zeigt, und 1) in dem Fall pretransfected Zielzellen auch Genomreplikation und sekundären Transkription ( dh Transkription von viraler Proteine produced in Zielzellen) in Zielzellen, oder 2) im Falle von naiven Zielzellen auch primäre Transkription (dh Transkription von viralen Proteinen in trVLPs in Zielzellen gebracht) (Abbildung 3). Wichtig ist, daß diese Systeme nur verwendet, um einen einzigen Infektionszyklus zu modellieren, und verlassen sich auf die Überexpression von allen viralen Proteinen, die im Fall von VP24 und VP40 ist besonders problematisch, da diese Proteine wurde gezeigt, dass starke negative Regulatoren der Genom-Replikation sein und wenn die Transkription von Plasmiden 12,13 überexprimiert. Ferner trVLP Vorbereitungen in diesen Systemen hergestellt werden, enthalten einen hohen Anteil an nicht-infektiösen Partikeln, posiert Herausforderungen für die biochemische Analyse von Infektions trVLPs 14.
Um diese Probleme zu überwinden, haben wir vor kurzem ein tetracistronic Minigenom System, das zusätzlich zu einem Reporter-Gen, enthält auch die Gene, die für VP40, GP 1,2 und entwickelteVP24 (Abbildung 1). Ähnlich dem klassischen monocistronisches Minigenom System führt dieses System für die Herstellung von trVLPs die Zielzellen infizieren können (Figur 4) 15. Im Gegensatz zur klassischen Minigenom System VP40, GP 1,2 und VP24 sind nach der viralen Genom-Transkription anstatt von Plasmiden überexprimiert hergestellt. Als Ergebnis wird die Kinetik und die Expressionsniveaus dieser Proteine viel enger imitieren die während des viralen Lebenszyklus festgestellt und damit das Verhältnis von infektiösen nicht-infektiösen trVLPs wird in diesem System 15 um etwa 500-fach. Ferner wurde unter Verwendung dieses Systems war es möglich, kontinuierlich Passage tetracistronic Minigenom haltigen trVLPs, Modellieren mehrerer Infektionszyklen. Als solche sind tetracistronic trVLPs derzeit umfassendste Lebenszyklus Modellierungssystem zur Verfügung zu Ebola-Virus Biologie unter BSL2- Bedingungen zu studieren. Hier informieren wir Sie ausführlich über den Einsatz of dieses Systems sowie der erwarteten Ergebnisse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die in diesem Manuskript beschrieben tetracistronic trVLP Assay ermöglicht die Modellierung des Ebola-Virus-Lebenszyklus über mehrere Infektionszyklen. Wichtig ist, die in diesem System produziert trVLPs enthalten nicht die genetische Information für die Nukleokapsidproteine NP, VP35, VP30 und L, die zusammen fast 60% des Ebola-Virus-Genom und sind essentiell für die virale Replikation. Vielmehr müssen diese Proteine in Zielzellen in trans von Expressionsplasmiden zur Verfügung gestellt werden, und jede Infektion der Zellen nicht exprimiert alle 4 dieser Proteine fehl. Wichtig ist, gibt es keine Hinweise auf die genetische Rekombination für Filoviren, und es gibt keine homologen Bereiche zwischen tetracistronic Minigenom und den Expressionsplasmiden für die Nukleokapsid-Proteinen geteilt. Deshalb gibt es weder eine praktische noch eine theoretische Beweise Basis, die für die Möglichkeit der Erzeugung von voller Länge Ebola-Virus-Genome, die dann möglicherweise in Folge haben könnte bieten könntedie Produktion von infektiösen Viren Ebola, so dass dieses System sicher für den Einsatz unter BSL2- Bedingungen.
Es gibt zwei wichtige Schritte in der tetracistronic trVLP Test, der von experimentellen Bedingungen beeinflusst werden, also die Produktion von trVLPs, und die Infektion der Zielzellen mit diesen trVLPs. Herstellung von trVLPs abhängt hohen Minigenom-Replikation und-Transkription, der wiederum von einem hohen Transfektionseffizienz. Transfektionseffizienz leicht, indem ein L Steuerung, bei der das Expressionsplasmid für L ist für ein Expressionsplasmid eGFP codiert ausgetauscht bewertet. Transfektionsraten unter diesen Bedingungen sollte durch Inspektion mit einem Fluoreszenzmikroskop 24 Stunden nach der Transfektion 50% überschreiten. Weiterhin haben Zellen frei von Mykoplasmen zu sein, da nach unserer Erfahrung Mykoplasmen-Kontaminationen dramatisch beeinträchtigt Minigenom-Replikation und Transkription (unveröffentlichte Daten). Aufgrund ihrer hohen Transfizierbarkeit 293 cells sind die Zelllinie der Wahl für trVLP Assays; Jedoch sind diese Zellen relativ schlecht anfällig (wenn auch nicht vollständig Brechungs) nach Infektion mit Ebola-Virus 16. Expression eines Befestigungsfaktor, wie Tim-1 erhöht Infektion von 293-Zellen mit trVLPs etwa 100-fach, und ist entscheidend für den Erfolg dieses Systems über mehrere Passagen.
Während tetracistronic trVLPs nicht selbst replizieren auf ihre eigenen, sie sind selbst replizieren in Zellen, die die Nukleokapsidproteine auszudrücken. Als solche müssen Vorkehrungen getroffen werden, um Kreuzkontaminationen zwischen den Wells mit verschiedenen trVLPs (zB mit unterschiedlichen Mutationen im Minigenom) zu vermeiden. Von einem technischen Standpunkt aus gesehen, aufgrund der großen Differenz zwischen positiven und negativen Signalen in diesem Assay (ca. 4 Stamm), ein Übersprechen zwischen den Proben bei der Messung der Luciferase-Aktivität, kann ein Problem sein; dies kann jedoch leicht durch Verlassen einer leeren Brunnen zwischen jeder Probe in die vermieden werden96-Well-Platte für die Messung Luciferase-Aktivität verwendet.
Es gibt eine Vielzahl von Anwendungsmöglichkeiten für tetracistronic trVLPs. Offensichtlich sind sie gut geeignet für die Untersuchung der Eingabe filovirus Teilchen, da Infektions trVLPs die typische gewindeartigen Struktur von Infektions Filoviren 14 und enthalten die gleichen Komponenten, wie virale Partikel filovirus. Wichtig ist, die nicht Bestandteil anderer Viren enthalten, wie es der Fall bei der Verwendung von pseudotypisierten Virionen oder virusartigen Partikeln, wie Retroviruspartikel tragenden GP 1,2 oder rekombinanten Viren, wie rekombinantes Virus der vesikulären Stomatitis exprimieren GP 1,2 . Die Anforderung für die Befestigung Faktoren bei der Verwendung 293-Zellen als Zielzellen in diesem System können zum Screening genutzt und untersuchen die Rolle solcher Haftungsfaktoren, während die Rollen der anderen zellulären Faktoren, wie die in der Genom-Replikation und Transkription beteiligt sowie Morphogenese und Knospeding, kann mit Hilfe der RNAi-Technologie untersucht werden. Der Effekt von Mutationen in der viralen Proteine auf der Viruslebenszyklus kann auch untersucht werden, auch wenn man im Hinterkopf behalten, dass, während VP40, GP 1,2 und VP24 sind nach der viralen Transkription ausgedrückt, wird die Expression der viralen Proteine von anderen Ausdruck erreicht Plasmide, so dass Effekte aufgrund der Überexpression dieser Proteine müssen berücksichtigt werden. Außerdem sollte darauf geachtet werden, dass Mutationen in der Minigenom nicht wesentlich über die Länge des Minigenoms ändern, da die Reporteraktivität direkt von Minigenom Länge 15 berührt. Da schließlich tetracistronic Minigenome sind virale Genom-Analoga, die Virusgene tragen, und werden durch die virale Polymerase-Komplex repliziert, sollte es auch möglich sein, um die Entwicklung dieser Gene als Antwort auf Mutationen unter BSL2 Bedingungen zu studieren. Während also noch weitere Studien in dieser Richtung erforderlich ist, sollte es möglich sein, beispielsweise zur Einführung suboptimalMutationen in Genen innerhalb der Minigenom und dann Durchgang, bis trVLPs kostenlose Mutationen entstehen.
Eine Einschränkung des tetracistronic trVLP Assay, der beachtet werden muss, ist die Tatsache, dass, während es die meisten Modelle des Virus-Lebenszyklus, primäre Transkription in Zielzellen wird durch dieses System nicht modelliert, da die Zielzellen haben, die Nucleocapsid-Proteine in trans auszudrücken Damit die trVLPs zu replizieren. Wenn primäre Transkription ist zu bewerten, ist es möglich, naive Zielzellen 10 zu verwenden; aber in diesem Fall kein Genom-Replikation in Zielzellen erfolgt und keine weiteren infektiösen trVLPs erzeugt, Abbrechen der Infektion. Dies ist ein Hauptproblem, das nicht ohne Rendering die trVLPs komplett selbst replizieren, indem die Gene für die Proteine in das Nukleokapsid Minigenom, die de facto machen sie zu infektiösen rekombinanten Viren Ebola würde überwunden werden können. Tatsächlich EbolA-Viren exprimieren Luciferase oder andere Reporter wurden generiert und können verwendet werden, um zu beurteilen und zu studieren Genom-Replikation und Transkription werden 17,18; allerdings ist ihr Einsatz auf BSL4 Labors beschränkt. Außerdem hat es zu berücksichtigen, dass während VP40, GP 1,2 und VP24 von einem viralen Genoms analogen Ausdruck, ihre Position in der Minigenom gehalten werden (2., 3., und 4. Transkriptionseinheit) ist nicht identisch mit ihre Position in dem viralen Genom (3., 4., 6. und Transkriptionseinheit), die die absolute Expressionsniveaus sowie ihre relativen Expressionsniveaus gegeneinander beeinflussen.
Insgesamt ist die tetracistronic trVLP Assay stellt die umfassendste Lebenszyklus-Modellierungssystem für Ebola-Viren bisher verfügbaren und ermöglicht die Modellierung von Genom-Replikation und Transkription, Partikel Morphogenese und angehenden sowie Befestigung und enversuchen in Zielzellen über mehrere Infektionszyklen. Als solche hat sie ein enormes Potenzial für den Einsatz bei der Untersuchung der Biologie von Ebola-Viren unter BSL2- Bedingungen.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren sind sehr dankbar, dass Bob Fischer (LV, DIR, NIAID, NIH), der als Erzähler fungierte, sowie Austin Athman (RTB, DIR, NIAID, NIH) und Megan Morgan (DOHS, ORS, OD, NIH) für ihre Hilfe mit der Herstellung der diese Handschrift begleitenden Film. Weiterhin möchten wir Allison Groseth (LV, DIR, NIAID, NIH) für kritische Durchsicht des Manuskripts danken. Diese Forschung wurde durch die Interne Research Program der NIH, NIAID unterstützt.
Materials
| 75cm2 cell culture flask | Corning | 430641 | |
| DMEM | Sigma | D6546 | preheat to 37°C prior to use |
| FBS | Life Technologies | 26140-079 | heat inactivate 30 min @ 56°C |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | 100X |
| Pen Strep | Life Technologies | 15070-063 | 100X |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-056 | |
| PBS | 8 g NaCl, 0.2g KCl, 1.44g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4, H2O ad 1 liter; autoclave and store at room temperature | ||
| 6-well plates | Costar | 3516 | |
| Opti-MEM I | Life Technologies | 31985-070 | |
| Transit LT1 | Mirus | MIR 2300 | |
| Glo lysis buffer | Promega | E2661 | |
| Renilla Glo luciferase assay system | Promega | E2720 | |
| 96-well assay plate (white) | Costar | 3912 | |
| Modulus microplate luminometer | Turner Microsystems | 998-9300 |
References
- Kuhn, J. H., et al. Evaluation of perceived threat differences posed by filovirus variants. Biosecurity and bioterrorism : biodefense strategy, practice, and science. 9, 361-371 (2011).
- Falzarano, D., Feldmann, H. Possible leap ahead in filovirus therapeutics. Cell research. , (2014).
- Hoenen, T., Groseth, A., Feldmann, H. Current ebola vaccines. Expert opinion on biological therapy. 12, 859-872 (2012).
- Beniac, D. R., et al. The organisation of ebola virus reveals a capacity for extensive, modular polyploidy. PloS one. 7, e29608 (2012).
- Basu, A., Mills, D. M., Bowlin, T. L., Enna, S. J. Chapter 13, Unit 13B 13, High-throughput screening of viral entry inhibitors using pseudotyped virus. Current protocols in pharmacology. , (2010).
- Wong, A. C., Sandesara, R. G., Mulherkar, N., Whelan, S. P., Chandran, K. A forward genetic strategy reveals destabilizing mutations in the Ebolavirus glycoprotein that alter its protease dependence during cell entry. J Virol. 84, 163-175 (2010).
- Muhlberger, E., Weik, M., Volchkov, V. E., Klenk, H. D., Becker, S. Comparison of the transcription and replication strategies of marburg virus and Ebola virus by using artificial replication systems. J Virol. 73, 2333-2342 (1999).
- Hoenen, T., Groseth, A., de Kok-Mercado, F., Kuhn, J. H., Wahl-Jensen, V. Minigenomes, transcription and replication competent virus-like particles and beyond: reverse genetics systems for filoviruses and other negative stranded hemorrhagic fever viruses. Antiviral Res. 91, 195-208 (2011).
- Hoenen, T., Feldmann, H. Reverse genetics systems as tools for the development of novel therapies against filoviruses. Expert Rev Anti Inf Ther. , 1253-1263 (2014).
- Hoenen, T., et al. Infection of naive target cells with virus-like particles: implications for the function of ebola virus VP24. J Virol. 80, 7260-7264 (2006).
- Watanabe, S., et al. Production of novel ebola virus-like particles from cDNAs: an alternative to ebola virus generation by reverse genetics. J Virol. 78, 999-1005 (2004).
- Hoenen, T., Jung, S., Herwig, A., Groseth, A., Becker, S. Both matrix proteins of Ebola virus contribute to the regulation of viral genome replication and transcription. Virology. 403, 56-66 (2010).
- Watanabe, S., Noda, T., Halfmann, P., Jasenosky, L., Kawaoka, Y. Ebola virus (EBOV) VP24 inhibits transcription and replication of the EBOV genome. J Infect Dis. 2 (196 Suppl 2), S284-S290 (2007).
- Spiegelberg, L., et al. Genus-specific recruitment of filovirus ribonucleoprotein complexes into budding particles. J Gen Virol. 92, 2900-2905 (2011).
- Watt, A., et al. A novel lifecycle modeling system for Ebola virus shows a genome length-dependent role of VP24 on virus infectivity. J Virol. , (2014).
- Kondratowicz, A. S., et al. T-cell immunoglobulin and mucin domain 1 (TIM-1) is a receptor for Zaire Ebolavirus and Lake Victoria Marburgvirus. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 8426-8431 (2011).
- Hoenen, T., Groseth, A., Callison, J., Takada, A., Feldmann, H. A novel Ebola virus expressing luciferase allows for rapid and quantitative testing of antivirals. Antiviral Res. 99, 207-213 (2013).
- Hoenen, T., et al. Inclusion bodies are a site of ebolavirus replication. J Virol. 86, 11779-11788 (2012).
