Tetracistronicミニゲノムを含むウイルス様粒子とバイオセーフティレベル2の条件の下ではエボラウイルスのライフサイクルのモデル化
Summary
感染エボラウイルスでの作業は、バイオセーフティーレベル4の研究室に限定されています。粒子（trVLPs）のようなTetracistronicミニゲノム含有複製と転写可能ウイルスは、私たちが安全にエボラウイルスのコンポーネントのみに頼って、バイオセーフティーレベル2の条件で複数の感染サイクルをモデル化することを可能にするライフサイクルモデリングシステムを表している。
Abstract
エボラウイルスは、90％と高い致死率で、ヒトおよび非ヒト霊長類において重篤な出血熱を引き起こす。があり、これらのウイルスに起因する疾患のための認可されたワクチンまたは特定の治療法はなく、感染性エボラウイルスでの作業が大幅にこれらのウイルスの研究を制限し、バイオセーフティーレベル4の研究室に限定されています。ライフサイクルモデリングシステムモデルバイオセーフティーレベル2の条件下で、ウイルスのライフサイクル;しかしながら、最近まで、そのようなシステムは、ウイルスのライフサイクルの各局面、または単一の感染サイクルのいずれかに限られていた。形態形成に関与Tetracistronicエボラウイルス非コード領域、レポーター遺伝子から成るミニゲノム、三エボラウイルス遺伝子、出芽、エントリ（VP40、GP 1,2、およびVP24）は、複製および転写を製造することができるこれらのミニゲノムを含む-competentウイルス様粒子（trVLPs）。これらtrVLPsは継続的にエボラを発現する細胞に感染することができます私たちは安全にバイオセーフティーレベル2の条件で複数の感染サイクルをモデル化することができ、ゲノム複製および転写を担うウイルスタンパク質、。重要なことは、このシステムのウイルス成分は、単独で（例えば、偽型ウイルスを使用するシステムの場合のように）、エボラウイルス由来ではなく、他のウイルスから誘導され、VP40、VP24およびGP 1,2は、このシステムにおいて過剰発現されていないこのようなゲノム複製および転写などのウイルスのライフサイクルの他の側面もこのシステムをモデル化することができますが、形態形成、出芽し、エントリを研究するために理想的に適して作る。したがって、tetracistronic trVLPアッセイはエボラウイルスの最も包括的なライフサイクルモデリングシステムであり、将来的にはエボラウイルスの生態を調査に使用するための非常に大きな可能性を秘めています。ここでは、このシステムの使用上だけでなく、期待される結果に関する詳細な情報を提供します。
Introduction
エボラウイルスは、人間の集団発生1で最大90％の致死率を持つヒトおよび非ヒト霊長類において重篤な出血熱の原因物質である。 （2,3にレビュー）、ワクチンだけでなく、具体的な治療法の開発に近年では大きな進展があったが、これらは、ヒトへの使用が承認されていない。エボラウイルス粒子は、約1μmの長さが特徴的な糸のような外観と96から98 nmの4の直径を有する。ヌクレオカプシド形ウイルス粒子のコア及び1からなる）7エボラウイルス遺伝子をコードする非セグメント化一本鎖ネガティブセンスRNAゲノム（ 図1）、ゲノムをキャプシド2）核タンパク質NP、3 ）ポリメラーゼLとその補因子VP35からなるウイルスポリメラーゼ複合体、及び4）転写アクチベーターVP30。また、最近では、タンパク質VP24はまた、ヌクレオキャプシドと関連していることが示されている秒4。ヌクレオカプシドは、ビリオンの形態形成および出芽に関与するマトリックスタンパク質VP40は、配置されるマトリクス空間に囲まれている。ウイルス粒子は、さらに、エンベロープ、およびそのエンベロープに埋め込 まれているビリオンの付着およびエントリに関与する唯一の表面タンパク質GP 1,2、である。
感染エボラウイルスでの仕事は、世界中のいくつかの施設にこの仕事を制限するバイオセーフティレベル（BSL）4条件下最大封じ込め実験室で行われなければならない。これらのウイルスの生物学を研究するため、またはBSL2条件下での新規治療薬を開発するために、研究者は、エボラウイルスタンパク質の組換えの過剰発現に、または感染性エボラウイルスの非存在下で加工することができるどちらもライフサイクルモデリングシステム、のいずれかに依存している。エボラウイルスタンパク質の組換え発現のいずれかの発現プラスミドまたはウイルスベクターから達成される。この戦略の特殊なケースである組換え的に研究することができるシュードタイピング粒子の生成につながる、GP 1,2表現の存在下で、ビリオンまたはエボラウイルス以外のウイルスに基づくウイルス様粒子の生成（最も一般的に口内炎ウイルス、レトロウイルスまたは水疱）侵入阻害剤5用のフィロウイルス、画面の入力プロセス。あるいは、独自の糖タンパク質の代わりに、エボラウイルスGP 1,2をコードする組換えウイルス（ 例えば 、水疱性口内炎ウイルス）が生成され、バイオセーフティーレベル2の条件6の下のウイルス侵入を研究するために使用することができる。
ライフサイクルモデリングシステムは、最初にcDNAから産生され、その後複製さトランスで提供エボラウイルスタンパク質によって転写される短縮型エボラウイルスゲノム類似体（ミニゲノム）の使用を特徴とする逆遺伝学系の形態である。エボラウイルスの最初のミニゲノムシステムは15年以上前に開発された7、および以降エボラウイルスゲノムの複製および転写（8,9に概説）を研究するために使用されている。このシステムでは、エボラウイルスゲノムの末端非コード領域に隣接し、単一のレポーター遺伝子から成るモノシストロンミニゲノムは、（T7のRNAポリメラーゼを用いて、通常の転写によって）哺乳動物細胞中で発現される（ 図1）（リーダーおよびトレーラーと呼ばれる）一緒にウイルスタンパクL、VP35、VP30およびNPと。ミニゲノムは、NPによってキャプシド化した後、複製され、ウイルスのライフサイクル（ 図2）、これらの二つの側面を反映しているレポーター活性につながる、リーダーおよびトレーラーに局在シス作用シグナルを使用して他のヌクレオカプシドタンパク質によって転写される。
ウイルスライフサイクルの追加の手順をモデル化するためには、転写および複製能力のあるウイルス様粒子（trVLP）システムは、古典的なミニゲノムシステムに基づいている、開発したが、Aを備えていてきた発現プラスミド10,11から他のウイルスタンパク質VP24、VP40およびGP 1,2のdditional式。 VP40の存在は、それらの表面上にGP 1,2を負担trVLPsの形成をもたらし、内側のミニゲノムを含むヌクレオカプシドを運ぶ。これらtrVLPs、 すなわち （trVLPs 11内の標的細胞に持ち込まミニゲノムの複製および転写を容易にするために、いずれかのL、VP35、VP30およびNPのための発現プラスミドでpretransfectedされた標的細胞を感染させるために使用される、またはナイーブ標的細胞であることができるエボラウイルスタンパク質のプラスミド-駆動発現なし）10。これは、trVLPsのプロデューサー細胞、形態形成および出芽においてミニゲノムの複製を反映して、標的細胞におけるレポーター活性をもたらす標的細胞への侵入、および1）pretransfected標的細胞の場合には、複製および二次転写（ゲノムウイルスタンパク質のprodによるすなわち転写uced）標的細胞内、標的細胞内、または2）また、ナイーブ標的細胞trVLPs内の標的細胞に持ち込まウイルスタンパク質）（ 図3）による一次転写（ すなわち 、転写の場合。これらのタンパク質は、ゲノム複製の強力な負の調節因子であることが示されているので、重要なことに、これらのシステムは、単一の感染サイクルをモデル化し、VP24およびVP40の場合に特に問題となる全てのウイルスタンパク質の過剰発現に依存することに使用されているプラスミド12,13から過剰発現し転写。さらに、これらのシステムで生成さtrVLP調製物は、感染trVLPs 14の生化学的解析のための課題を提起、非感染性粒子の割合が高いが含まれています。
これらの問題を克服するために、本 発明者らは最近、レポーター遺伝子に加えて、VP40、GP 1,2とをコードする遺伝子が含まれ、tetracistronicミニゲノムシステムを開発したVP24（ 図1）。古典的なモノシストロニックミニゲノムシステムと同様に、このシステムは、（ 図4）15標的細胞に感染することができるtrVLPsの産生をもたらす。しかし、古典的なミニゲノムシステムとは対照的に、VP40、GP 1,2、およびVP24ではなくプラスミドから過剰発現されるよりも、ウイルスゲノムの転写後に生成される。その結果、これらのタンパク質の動態および発現レベルは、はるかに密接にウイルスライフサイクル中に見られるものを模倣し、したがって非感染性trVLPsへの感染の割合は、このシステム15において約500倍増加している。さらに、このシステムを使用して、連続的継代tetracistronicミニゲノム含有trVLPsを、複数の感染サイクルをモデル化することが可能であった。このように、tetracistronic trVLPsは現在、BSL2条件でエボラウイルスの生物学を研究するために利用できる最も包括的なライフサイクルモデリングシステムである。ここでは、使用O上の詳細な情報を提供するこのシステムFだけでなく、期待される結果について。
Protocol
Representative Results
Discussion
この原稿に記載されtetracistronic trVLPアッセイは、いくつかの感染サイクルにわたってエボラウイルスのライフサイクルのモデル化を可能にする。重要なのは、このシステムで生産さtrVLPsは一緒にエボラウイルスゲノムのほぼ60％を構成し、ウイルスの複製に必須であるヌクレオカプシドタンパク質NP、VP35、VP30、およびL、遺伝情報が含まれていません。むしろ、これらのタンパク質は、発現プラスミドからトランスでの標的細胞に設ける必要はなく、これらのタンパク質のすべての4を発現する細胞の任意の感染は不稔である。重要なことは、フィロウイルスのための遺伝子組換えの証拠はない、とtetracistronicミニゲノム及びヌクレオカプシドタンパク質のための発現プラスミドの間で共有なかっ相同領域はありません。したがって、任意の実用的な証拠も潜在的に原因となり、全長エボラウイルスゲノムを生成する可能性を提供する可能性のある理論的根拠もないとされている感染エボラウイルスの産生、BSL2条件下での使用のためにこのシステムを安全にすること。
つの重要なtrVLPsの産生、すなわち 、実験条件によって影響を受けるtetracistronic trVLPアッセイの手順、およびこれらのtrVLPsによる標的細胞の感染がある。 trVLPsの生産は、今度は、高いトランスフェクション効率に依存する、ミニゲノム複製および転写の高いレベルに依存している。トランスフェクション効率を容易L発現プラスミドは、eGFPをコードする発現プラスミドのために交換される-Lコントロールを含めることによって評価することができる。これらの条件下でトランスフェクション率は、トランスフェクションの24時間ポスト蛍光顕微鏡で検査することによって50％を超えている必要があります。私たちの経験ではマイコプラズマ汚染が劇的ミニゲノム複製および転写（未発表データ）を損なうので、細胞は、マイコプラズマがないことがあります。その高いトランスフェクション能力293 CEへLLSはtrVLPアッセイのために選択される細胞株である。しかしながら、これらの細胞は、エボラウイルス16感染に（完全に屈折しないが）比較的乏しい感受性である。そのようなTIM-1などの接着因子の発現は、約100倍trVLPsで293細胞の感染を高め、数継代にわたってこのシステムの成功のために不可欠である。
tetracistronic trVLPsが自分自身で自己複製ではありませんが、彼らはヌクレオキャプシドタンパク質を発現する細胞内で自己複製します。そのため、予防措置は（ミニゲノム中の異なる変異を有するなど ）が異なるtrVLPsを含むウェル間のクロスコンタミネーションを回避するために行う必要があります。より技術的な観点から、原因は、このアッセイで正と負の信号間の差が大きい（約4ログ）に、サンプル間のクロストークルシフェラーゼ活性を測定する場合には問題となることがあります。しかし、これは簡単には、各試料間の1つの空のウェルを残すことによって回避することができるルシフェラーゼ活性を測定するために使用される96ウェルプレート。
tetracistronic trVLPsの可能な多数のアプリケーションがあります。感染trVLPs、感染フィロ14の典型的な糸状構造であり、フィロウイルス粒子と同じウイルス成分が含まれているため、明らかに、それらは、フィロウイルス粒子の侵入を研究によく適している。偽型ウイルス粒子またはレトロウイルスGP 1,2を有する粒子、またはそのようなGP 1,2を発現する組換え水疱性口内炎ウイルスなどの組換えウイルスのようなウイルス様粒子を使用するときの場合のように重要なのは、それらは、他のウイルスの成分を含まない。付着因子の要件この系における標的細胞、293細胞を用いて、画面に活用し、このような結合因子の役割を研究することができる一方、そのようなゲノムの複製と転写に関与するものなどの他の細胞因子の役割、ならびに形態形成および芽鼎は、RNAi技術を使用して調べることができる。一つはVP40、GP 1,2、およびVP24がウイルス転写後に発現している間、他のウイルスタンパク質の発現は、式から達成されていることを心に留めておく必要がありますが、ウイルスのライフサイクル上のウイルスタンパク質における変異の効果も、研究することができるプラスミドを、これらのタンパク質の過剰発現に起因する影響を考慮しなければならないようにする。また、ケアはレポーター活性を直接ミニゲノム長さ15の影響を受けるため、ミニゲノムの変異が大きく、ミニゲノムの長さを変えないように注意すべきである。 tetracistronicミニゲノムは、ウイルス遺伝子を運ぶウイルスゲノムの類似体であり、ウイルスポリメラーゼ複合体により複製されるので、最後に、それはまた、BSL2条件下での突然変異に応じて、これらの遺伝子の進化を研究することが可能であるべきである。さらなる研究はまだこの方向に必要とされるつつ、それが可能であるべきであり、例えば、準最適導入するミニゲノム内の遺伝子に突然変異した後、通路trVLPs無料の変異が現れるまで。
留意しなければならないtetracistronic trVLPアッセイの1つの制限は、モデルウイルスのライフサイクルのほとんどをしながら、標的細胞は、トランスにおけるヌクレオキャプシドタンパク質を発現する必要があるため、標的細胞の一次転写が、このシステムによってモデル化されていないという事実であるtrVLPsが複製するためには。一次転写を評価する必要がある場合には、ナイーブ標的細胞10を使用することが可能である。ただし、この場合には、ゲノムの複製は、標的細胞内で行われず、これ以上の感染trVLPs、感染を中止し、生産されていません。これは事実上の感染性組換えエボラウイルスに変えるだろうミニゲノムへのヌクレオカプシド蛋白質の遺伝子を含むことによって、完全に自己複製をtrVLPsをレンダリングせずに克服することができない主要な問題である。実際には、Ebolルシフェラーゼまたは他のレポーターが生成されたと評価し、ゲノムの複製および転写17,18を研究するために利用することができる発現するウイルス;しかしながら、それらの使用はBSL4研究所に制限される。また、VP40、GP 1,2、およびVP24がウイルスゲノムアナログから発現している間、ミニゲノム内の位置（ 第2、第3、および第 4の転写ユニット）と同一ではないことに留意する必要がある互いに対してそれらの絶対的な発現レベル、ならびにそれらの相対的な発現レベルに影響を与える可能性があり、ウイルスゲノム内の位置（3 番目 、4 番目 、および6 番目の転写単位）。
全体的に、tetracistronic trVLPアッセイは、これまでの利用可能なエボラウイルスのための最も包括的なライフサイクルモデリングシステムを表し、添付ファイルと専用だけでなく、ゲノムの複製および転写、粒子形態形成および出芽のモデリングを可能にする複数の感染サイクルにわたって標的細胞にしてみてください。このように、BSL2条件下でエボラウイルスの生物学を調査に使用するための多大な可能性を秘めている。
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、ボブ·フィッシャー（LV、DIR、NIAID、NIH）、ナレーターを務めただけでなく、オースティンAthman（RTB、DIR、NIAID、NIH）とミーガン·モーガン（DOHS、ORS、OD、NIH）のために非常に感謝していますこの原稿を伴う映画を作る際の彼らの助け。さらに、私たちは原稿の重要な読書のためのアリソンGroseth（LV、DIR、NIAID、NIH）を感謝したいと思います。この研究は、NIH、NIAIDの学内研究プログラムによってサポートされていました。
Materials
| 75cm2 cell culture flask | Corning | 430641 | |
| DMEM | Sigma | D6546 | preheat to 37°C prior to use |
| FBS | Life Technologies | 26140-079 | heat inactivate 30 min @ 56°C |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | 100X |
| Pen Strep | Life Technologies | 15070-063 | 100X |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-056 | |
| PBS | 8 g NaCl, 0.2g KCl, 1.44g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4, H2O ad 1 liter; autoclave and store at room temperature | ||
| 6-well plates | Costar | 3516 | |
| Opti-MEM I | Life Technologies | 31985-070 | |
| Transit LT1 | Mirus | MIR 2300 | |
| Glo lysis buffer | Promega | E2661 | |
| Renilla Glo luciferase assay system | Promega | E2720 | |
| 96-well assay plate (white) | Costar | 3912 | |
| Modulus microplate luminometer | Turner Microsystems | 998-9300 |
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