This method demonstrates a technique for assessing granulocyte function by simultaneously measuring phagocytosis of bacteria and oxidative burst. Image-based flow cytometry allowed for the identification of three distinct subsets of activated granulocytes that all differed in their relative functional capacity.
Granulocytes play a key role in the body’s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte function, in general these are limited in terms of the information they can provide. For example, most existing assays merely provide a percentage of how many granulocytes are activated following a single, fixed length incubation. Complicating matters, most assays focus on only one aspect of function due to limitations in detection technology. This report demonstrates a technique for simultaneous measurement of granulocyte phagocytosis of bacteria and oxidative burst. By measuring both of these functions at the same time, three unique phenotypes of activated granulocytes were identified: 1) Low Activation (minimal phagocytosis, no oxidative burst), 2) Moderate Activation (moderate phagocytosis, some oxidative burst, but no co-localization of the two functional events), and 3) High Activation (high phagocytosis, high oxidative burst, co-localization of phagocytosis and oxidative burst). A fourth population that consisted of inactivated granulocytes was also identified. Using assay incubations of 10, 20, and 40-min the effect of assay incubation duration on the redistribution of activated granulocyte phenotypes was assessed. A fourth incubation was completed on ice as a control. By using serial time incubations, the assay may be able to able to detect how a treatment spatially affects granulocyte function. All samples were measured using an image-based flow cytometer equipped with a quantitative imaging (QI) option, autosampler, and multiple lasers (488, 642, and 785 nm).
Granulociti costituiscono una componente di sistema immunitario innato del corpo, che fornisce la prima linea di difesa contro gli antigeni invasori. I metodi precedenti per valutare la funzione dei granulociti concentrati sulla capacità di fagocitosi o burst ossidativo con metodi diversi, il che rende difficile accertare collettivamente come granulociti sono cambiati 1-4. I progressi nel campo della citometria a flusso hanno portato alla produzione di strumenti da banco capaci di alta risoluzione, multicolore imaging cellule in maniera high throughput 5. La capacità di coniugare l'imaging con il flusso tradizionale rappresenta citometria un avanzamento che fornisce la piattaforma tecnologica necessaria per innovare nel flusso esistenti citometria metodi ed estrarre nuove informazioni sul sistema immunitario.
Negli ultimi dieci anni, il nostro laboratorio, tra gli altri, è stato acutamente focalizzata sull'effetto di vari patte nutrizionale e trattamenti eserciziorns sulla funzione immunitaria innata 6-9. Il metodo illustrato in questo manoscritto ha implicazioni pratiche nel campo della immunologia clinica. Il presente metodo sfrutta la potenza di image-based citometria a flusso per misurare simultaneamente la fagocitosi di particelle batteriche e burst ossidativo. Usando questo approccio, si è in grado di separare granulociti attivati utilizzando variabili forniti dalla parte dell'immagine basata dell'analisi. Questi sottoinsiemi erano identificabili solo dopo aver valutato le immagini cellulari sui singoli granulociti. Ulteriore tempo di incubazione test influenzato la transizione tra i tre sottoinsiemi di attivazione 10. Così, è plausibile che uso di più tempi di incubazione può autorizzare un metodo per testare l'cambiamento nella funzione granulociti seguendo un trattamento sperimentale specifica. Lo scopo di questo manoscritto era di dimostrare un metodo di valutazione della funzione dei granulociti utilizzando un'immagine basata citometria a flusso per misurare simultaneamente fagocitosi con oxidative scoppiare.
L'attuale metodo rappresenta un perfezionamento dei metodi esistenti per la valutazione della funzione dei granulociti citometria a flusso 1,3,4,12-14. I passaggi critici di questo test tendono ad essere correlato alla corretta miscelazione del campione di sangue con i bioparticelle e DHE. Miscelazione incompleta si tradurrà in risultati imprecisi. Mentre la completa miscelazione è critica, il metodo di miscelazione deve essere dolce in natura. Si suggerisce che la miscelazione essere realizzato utilizzando una pipetta elettronico con una funzione di miscelazione piuttosto che un vortex. Un altro punto critico nel saggio è garantire sempre non c'è sangue contaminare la metà superiore della provetta. Questo sangue residuo può essere rimosso con un cotton fioc sterili. La rimozione completa è importante perché in caso contrario si potrebbe contaminare la preparazione finale del test con i globuli rossi non-lisato.
Prima di utilizzare questo metodo di adeguati controlli di compensazione dovrebbe essere aggiunto al controllo per spectral sovrapposizione tra i reagenti utilizzati per identificare i diversi aspetti della funzione di granulociti. Per questo metodo, controlli di compensazione comportano raccogliere campioni di sangue che sono stati suggeriti 40 min di incubazione dosaggio e poi etichettatura con un singolo marcatore (cioè, E. coli, DHE, ecc). Dopo l'etichettatura, i singoli eventi positivi vengono raccolti e una matrice di compensazione viene generato tramite un wizard automatico nel software di analisi IDEE. E 'fondamentale che se si utilizza questo test, adeguati controlli di compensazione sono stati completati per garantire prestazioni adeguate del dosaggio.
L'analisi viene eseguita mediante la funzione Finder e co-localizzazione procedure guidate per identificare che brillante intensità dettaglio è il miglior variabile per separare le popolazioni ed anche identificare come esiste molta sovrapposizione tra burst ossidativo e segnali fagocitosi. In particolare, l'uso di immagini basato citometria disponibile la capacità di separare granulociti attivati in tre sottoinsiemi. Tla sua ripartizione sottoinsieme è stato determinato utilizzando luminosa intensità dettaglio di fagocitosi vs. burst ossidativo. Oltre a esaminare queste funzioni cellulari singolari, cellule che mostravano entrambi gli eventi contemporaneamente nella stessa posizione anatomica (co-localizzazione) sono stati identificati. Granulociti che cadde nel sottoinsieme "high-attiva" erano l'unico che ha dimostrato fenotipo coerente co-localizzazione tra fagocitosi e burst ossidativo. Questa identificazione di sottoinsiemi granulociti attivati è la più grande area in cui è necessaria la risoluzione dei problemi. E 'molto importante per un nuovo utente di prendere tempo per capire il workflow di processo del campione in idee e per capire i meccanismi di gating le popolazioni cellulari utilizzando il componente di imaging. Altre modifiche che un utente può cercare di rendere comprendono la selezione dei tempi alterni o ulteriori test di incubazione. Il metodo attuale suggerisce l'uso di una durata di 10-40 min; Tuttavia, a seconda del modello sperimentale in cui questo metodo èda utilizzare, può essere necessario selezionare durate dosaggio più. Tale modifica dovrebbe essere valutato su base individuale.
Inoltre è stato stabilito che la durata dell'incubazione dosaggio ha un effetto significativo sulla comparsa delle tre sottoinsiemi attivati. L'approccio descritto in questo rapporto rappresenta un ampliamento di quali informazioni possono essere ottenute in precedenza per quanto riguarda la funzione di granulociti 3,4,13,15. Altri laboratori hanno dimostrato l'importanza di valutare i cambiamenti nella funzione dei granulociti nel quadro di una valutazione globale di immunità e malattia 15-17. Nonostante il potenziale di questo test non è senza limitazioni. Una delle maggiori limitazioni è domanda Costi e tempi associati con elevata campione trasformazione produttività. Quando un disegno studio richiede un gran numero di campioni in un dato giorno, questi possono essere difficili da trattare. Il trattamento è semplificato dall'uso di pipette elettroniche e dispenser,ma queste tendono ad essere costosi e non sono necessariamente disponibili in ogni laboratorio.
La nostra area di ricerca si concentra su uno studio di come l'esercizio fisico e le abitudini alimentari influenzano la salute del sistema immunitario e la funzione 6,8-10,18-20. Tali obiettivi hanno importanti implicazioni pratiche per una varietà di aree della salute umana. Oltre lo studio di esercizio e nutrizionali effetti il metodo fagocitosi dimostrato in questo manoscritto potrebbe essere utile in altre zone del immunologia clinica dove il monitoraggio delle funzioni fagocitosi è fondamentale per i risultati del trattamento. Il presente saggio è il primo di molti che saggi immunologici con la possibilità di essere reinventate prendendo i vantaggi delle informazioni di imaging unica che può essere in grado da un flusso basato su immagini citometro.
The authors have nothing to disclose.
The present study was funded in part by a Research Initiation Grant (RIG) from the University of North Texas to Dr. McFarlin. The authors did not receive direct funding for the completion of this study and report no conflict of interest.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Vacutainers | BD Life Sciences | used for blood collection | |
WBC Fixative / RBC Lysis solution | eBioscience | 00-5333-57 | |
CD66b-APC | eBioscience | clone G10F5 | |
CD45-APCeFluor780 | eBioscience | clone 2D1 | |
s.aureus bioparticles | Life Technologies | A10010 | |
dihydroethidium | Sigma-Aldrich | D7008 | |
N-ethylmalemide | Sigma-Aldrich | 4259 | |
7AAD | EMD Millipore | ||
Hematology Analyzer | Mindray | BC-3200 | |
96-channel pipet | Integra Biosciences | ViaFlo | |
Bead Bath Incubator | LabArmour | BeadBath | |
Imaging Flow Cytometer | EMD Millipore | Amnis FlowSight | |
INSPIRE Software | EMD Millipore | Amnis INSPIRE | |
IDEAS Software | EMD Millipore | Amnis IDEAS | |
X-Pierce Piercable Plate Sealer | Excel Scientific, Inc. | X-Pierce | |
Dell Precision Workstation | Dell Computers | Various | Used for IDEAS analysis |