טכניקת cytometry הזרימה מבוססת תמונה כדי להעריך את השינויים בפונקצית granulocyte<em> במבחנה</em
Summary
This method demonstrates a technique for assessing granulocyte function by simultaneously measuring phagocytosis of bacteria and oxidative burst. Image-based flow cytometry allowed for the identification of three distinct subsets of activated granulocytes that all differed in their relative functional capacity.
Abstract
Granulocytes play a key role in the body’s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte function, in general these are limited in terms of the information they can provide. For example, most existing assays merely provide a percentage of how many granulocytes are activated following a single, fixed length incubation. Complicating matters, most assays focus on only one aspect of function due to limitations in detection technology. This report demonstrates a technique for simultaneous measurement of granulocyte phagocytosis of bacteria and oxidative burst. By measuring both of these functions at the same time, three unique phenotypes of activated granulocytes were identified: 1) Low Activation (minimal phagocytosis, no oxidative burst), 2) Moderate Activation (moderate phagocytosis, some oxidative burst, but no co-localization of the two functional events), and 3) High Activation (high phagocytosis, high oxidative burst, co-localization of phagocytosis and oxidative burst). A fourth population that consisted of inactivated granulocytes was also identified. Using assay incubations of 10, 20, and 40-min the effect of assay incubation duration on the redistribution of activated granulocyte phenotypes was assessed. A fourth incubation was completed on ice as a control. By using serial time incubations, the assay may be able to able to detect how a treatment spatially affects granulocyte function. All samples were measured using an image-based flow cytometer equipped with a quantitative imaging (QI) option, autosampler, and multiple lasers (488, 642, and 785 nm).
Introduction
גרנולוציטים מייצגים רכיב אחד של המערכת החיסונית של הגוף המולדת, אשר מספקת את קו הגנה הראשון נגד אנטיגנים פולשים. שיטות קודמות להערכת תפקוד granulocyte התמקדו בקיבולת phagocytosis או פרץ חמצוני בשיטות נפרדות, ולכן קשה לקבוע באופן קולקטיבי איך גרנולוציטים השתנו 1-4. התקדמות בתחום הזרימה cytometry הביאו בייצור של מכשירים המעבדתיים מסוגלים ברזולוציה גבוהה, הדמיה צבע רב של תאים באופן תפוקה גבוהה 5. היכולת לשלב הדמיה עם זרימה מסורתית cytometry מייצגת התקדמות שמספקת את הפלטפורמה הטכנולוגית הדרושה כדי לחדש בתוך זרימה הקיימת cytometry שיטות ולחלץ מידע חדש על המערכת החיסונית.
במהלך עשר השנים האחרונות, המעבדה שלנו, בין יתר, התמקדה בחריפות על ההשפעה של patte התזונתי וטיפולי מימוש השוניםRNS על תפקוד מערכת חיסון מולדים 6-9. יש השיטה הוכיחה בכתב היד הזה השלכות מעשיות בתחום האימונולוגיה קלינית. השיטה הנוכחית ממנפת את הכח של הזרימה cytometry מבוסס תמונה למדוד phagocytosis של חלקיקי חיידקים ופרץ חמצוני בו זמנית. שימוש בגישה זו, אחד הוא מסוגלת להפריד גרנולוציטים מופעלים באמצעות משתנים הניתנים על ידי החלק מבוסס דמותו של הניתוח. תת אלה היו רק זיהוי לאחר הערכת התמונות הסלולריות על גרנולוציטים הבודדים. זמן הדגירה assay נוסף השפיע על המעבר בין תת הפעלת שלוש 10. לכן, זה מתקבל על הדעת ששימוש במספר רבה של פעמים דגירה עשוי לאפשר שיטה לבחון את השינוי בתפקוד granulocyte הבא טיפול ניסיון ספציפי. המטרה של כתב היד הזה הייתה להדגים שיטה של פונקצית granulocyte הערכה באמצעות זרימה cytometry מבוסס תמונה למדוד phagocytosis עם oxidat בו זמניתive פרץ.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטה הנוכחית מייצגת עידון של שיטות קיימות להערכת תפקוד granulocyte באמצעות זרימת cytometry 1,3,4,12-14. השלבים הקריטיים של assay זה נוטים להיות קשור לערבוב נכון של דגימת הדם עם bioparticles וDHE. ערבוב שלם יביא לתוצאות לא מדויקות. בעוד ערבוב מלא הוא קריטי, שיטת הערבוב צריכה להיות עדינה בטבע. הוא הציע כי הערבוב להתבצע באמצעות pipet אלקטרוני עם פונקצית ערבוב ולא מיקסר מערבולת. עוד צעד קריטי בassay הוא תמיד כדי להבטיח שאין דם מזהם את חיצו העליון של צינור assay. דם שיורית זו ניתן להסיר באמצעות המוליך כותנה שקצה סטרילי. הסרה מלאה היא חשובה משום שכישלון לעשות זאת עלולה לזהם את הכנת assay הסופית עם תאי דם אדום-lysed un.
לפני השימוש בשיטה זו בקרות פיצוי הולמות יש להוסיף לשלוט על spחפיפה בין ectral חומרים כימיים המשמשים לזיהוי ההיבטים השונים של תפקוד granulocyte. לשיטה זו, בקרות פיצוי כרוכות לאסוף דגימות דם שהוצעו הדגירה assay 40 דקות ולאחר מכן תיוג עם סמן יחיד (כלומר, E. coli, DHE, וכו '). לאחר תיוג, אירועים חיוביים יחידים נאספים ומטריצת פיצוי מופקת באמצעות אשף אוטומטי בתוכנת ניתוח רעיונות. זה קריטי, כי אם נעשה שימוש assay זה, בקרות פיצוי הולמות הושלמו כדי להבטיח ביצועי assay נכונים.
ניתוח מתבצע באמצעות אשפי מאתר התכונה ושיתוף לוקליזציה לזהות שעוצמת פירוט בהירה היא משתנה הטוב ביותר להפריד בין האוכלוסיות וגם לזהות כמה חפיפה קיימת בין פרץ חמצוני ואותות phagocytosis. באופן ספציפי, השימוש בcytometry מבוסס תמונה סיפק את היכולת להפריד גרנולוציטים הופעלו לשלוש תת קבוצות. Tפירוט משנו נקבע באמצעות עוצמת פירוט בהירה של phagocytosis לעומת פרץ חמצוני. בנוסף לבחינת פונקציות תא היחידה אלה, תאים שהציגו שני אירועים באותו הזמן באותו מיקום האנטומי (שיתוף לוקליזציה) זוהו. גרנולוציטים שנפלו לקבוצת המשנה "גבוה-האקטיבי" היו פנוטיפ היחיד שהפגין שיתוף לוקליזציה עקבית בין phagocytosis ופרץ חמצוני. זיהוי זה של תת granulocyte מופעל הוא האזור הגדול ביותר שבו יש צורך בפתרון בעיות. זה מאוד חשוב עבור משתמש חדש כדי לקחת את הזמן כדי להבין את זרימת העבודה תהליך הדגימה ברעיונות ולהבין את המכניקה של gating אוכלוסיות תאים באמצעות רכיב ההדמיה. שינויים אחרים שהמשתמש יכול לנסות ולהפוך כוללים מבחר של פעמים דגירה assay חלופיות או נוספות. השיטה הנוכחית מצביעה על השימוש בתקופות של 10-40 דקות; עם זאת, בהתאם לדגם הניסיוני שבה שיטה זו היאכדי לשמש, זה עשוי להיות נחוץ כדי לבחור משכי assay עוד. כגון שינוי היית צריך להיות מוערך על בסיס פרטני.
עוד נקבע כי משך הדגירה assay יש השפעה משמעותית על המראה של שלוש תת קבוצות הופעלו. הגישה המתוארת בדוח זה מייצגת הארכת איזה מידע ניתן להשיג בעבר לגבי תפקוד granulocyte 3,4,13,15. מעבדות אחרות לא הוכיחו את החשיבות של הערכת שינויים בתפקוד granulocyte כחלק מהערכה מקיפה של חסינות ומחלות 15-17. למרות הפוטנציאל של assay זה זה לא בלי מגבלות. אחת המגבלות העיקריות הוא דרישת עלות וזמן הקשורים גבוה מדגם עיבוד תפוקה. כאשר עיצוב מחקר דורש מספר רב של דגימות ביום נתון, אלה יכולים להיות קשים לעיבוד. עיבוד הוא יעיל על ידי השימוש במכשירים אלקטרוני וpipets,אבל אלה נוטים להיות יקרים ולא בהכרח זמינים בכל מעבדה.
האזור שלנו של מחקר מתמקד במחקר של כמה פעילות גופנית והרגלי תזונה משפיעים על בריאות מערכת חיסונית ולתפקד 6,8-10,18-20. יש יעדים כגון השלכות מעשיות משמעותיות עבור מגוון רחב של תחומי בריאות אדם. מעבר ללימוד השפעות הפעילות הגופנית ולתזונה בשיטת phagocytosis הפגינה בכתב יד זה יכול להיות שימושית בתחומים אחרים של אימונולוגיה קלינית בי הניטור של תפקוד phagocytosis הוא קריטי לתוצאות טיפול. Assay הנוכחי הוא הראשון מני רבים שמבחנים אימונולוגיים עם הפוטנציאל להיות מחדש שהומצאו על ידי לקיחת יתרונות של מידע ההדמיה הייחודי שיכול להיות יכול מזרימה מבוססת תמונה cytometer.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The present study was funded in part by a Research Initiation Grant (RIG) from the University of North Texas to Dr. McFarlin. The authors did not receive direct funding for the completion of this study and report no conflict of interest.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Vacutainers | BD Life Sciences | used for blood collection | |
| WBC Fixative / RBC Lysis solution | eBioscience | 00-5333-57 | |
| CD66b-APC | eBioscience | clone G10F5 | |
| CD45-APCeFluor780 | eBioscience | clone 2D1 | |
| s.aureus bioparticles | Life Technologies | A10010 | |
| dihydroethidium | Sigma-Aldrich | D7008 | |
| N-ethylmalemide | Sigma-Aldrich | 4259 | |
| 7AAD | EMD Millipore | ||
| Hematology Analyzer | Mindray | BC-3200 | |
| 96-channel pipet | Integra Biosciences | ViaFlo | |
| Bead Bath Incubator | LabArmour | BeadBath | |
| Imaging Flow Cytometer | EMD Millipore | Amnis FlowSight | |
| INSPIRE Software | EMD Millipore | Amnis INSPIRE | |
| IDEAS Software | EMD Millipore | Amnis IDEAS | |
| X-Pierce Piercable Plate Sealer | Excel Scientific, Inc. | X-Pierce | |
| Dell Precision Workstation | Dell Computers | Various | Used for IDEAS analysis |
References
- Kong, M., et al. The effect of alpha-fetoprotein on the activation and phagocytosis of granulocytes and monocytes. Hepatogastroenterology. 59, 2385-2388 (2012).
- Prakash, P. S., Caldwell, C. C., Lentsch, A. B., Pritts, T. A., Robinson, B. R. Human microparticles generated during sepsis in patients with critical illness are neutrophil-derived and modulate the immune response. J. Trauma Acute Care Surg. 73, 401-406 (2012).
- Salih, H. R., Husfeld, L., Adam, D. Simultaneous cytofluorometric measurement of phagocytosis, burst production and killing of human phagocytes using Candida albicans and Staphylococcus aureus as target organisms. Clin. Microbiol. Infect. 6, 251-258 (2000).
- Tsuji, S., Iharada, A., Taniuchi, S., Hasui, M., Kaneko, K. Increased production of nitric oxide by phagocytic stimulated neutrophils in patients with chronic granulomatous disease. J. Pediatr. Hematol. Oncol. 34, 500-502 (2012).
- Ortyn, W. E., et al. Sensitivity measurement and compensation in spectral imaging. Cytometry A. 69, 852-862 (2006).
- McFarlin, B. K., et al. A one-year school-based diet/exercise intervention improves non-traditional disease biomarkers in Mexican-American children. Matern. Child Nutr. 9, 524-532 (2013).
- McFarlin, B. K., Johnson, C. A., Moreno, J. P., Foreyt, J. P. Mexican-American Children have differential elevation of Metabolic Biomarkers that is proportional to Obesity Status. J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. , (2013).
- Strohacker, K., et al. Moderate-intensity, premeal cycling blunts postprandial increases in monocyte cell surface CD18 and CD11a and endothelial microparticles following a high-fat meal in young adults. Appl. Physiol. Nutr. Metab. 37, 530-539 (2012).
- Carpenter, K. C., Breslin, W. L., Davidson, T., Adams, A., McFarlin, B. K. Baker’s yeast beta-glucan supplementation increases monocytes and cytokines post-exercise: implications for infection risk. Br. J. Nutr. , 1-9 (2012).
- McFarlin, B. K., Williams, R. R., Venable, A. S., Dwyer, K. C., Haviland, D. L. Image-based cytometry reveals three distinct subsets of activated granulocytes based on phagocytosis and oxidative burst. Cytometry A. 83, 745-751 (1002).
- McFarlin, B. K., Williams, R. R., Venable, A. S., Dwyer, K. C., Haviland, D. L. Image-based cytometry reveals three distinct subsets of activated granulocytes based on phagocytosis and oxidative burst. Cytometry A. 83, 745-751 (2013).
- Ichii, H., et al. Iron sucrose impairs phagocytic function and promotes apoptosis in polymorphonuclear leukocytes. Am J Nephrol. 36, 50-57 (2012).
- Ploppa, A., George, T. C., Unertl, K. E., Nohe, B., Durieux, M. E. ImageStream cytometry extends the analysis of phagocytosis and oxidative. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 71, 362-369 (2011).
- Van Amersfoort, E. S., Van Strijp, J. A. Evaluation of a flow cytometric fluorescence quenching assay of phagocytosis of sensitized sheep erythrocytes by polymorphonuclear leukocytes. Cytometry. 17, 294-301 (1994).
- Gullstrand, B., et al. Combination of autoantibodies against different histone proteins influences complement-dependent phagocytosis of necrotic cell material by polymorphonuclear leukocytes in systemic lupus erythematosus. J. Rheumatol. 39, 1619-1627 (2012).
- Fierro, M. T., et al. Functional and phenotypical impairment of polymorphonuclear cells in atopic dermatitis: an additional cause for the known susceptibility to infections. Dermatology. 224, 323-330 (2012).
- Gruger, T., et al. Negative impact of linezolid on human neutrophil functions in vitro. Chemotherapy. 58, 206-211 (2012).
- McFarlin, B. K., Venable, A. S. Measurement of Low Concentration Human Serum Cytokines using a Millipore High-Sensitivity Milliplex Assay. J. Vis. Exp. , (2014).
- McFarlin, B. K., Carpenter, K. C., Davidson, T., McFarlin, M. A. Baker’s Yeast Beta Glucan Supplementation Increases Salivary IgA and Decreases Cold/Flu Symptomatic Days After Intense Exercise. J. Diet. Suppl. 10, 171-183 (2013).
- McFarlin, B. K., Carpenter, K. C., Strohacker, K., Breslin, W. L. Comparison of blood monocytes and adipose tissue macrophages in a mouse model diet-induced weight gain. Comp. Med. 62, 462-465 (2012).
