Выделение и количественный Иммуноцитохимическая Характеристика первичных Миогенные клеток и фибробластов из человеческих скелетных мышц

Ремонт и восстановление скелетных мышц требуется действие спутниковых клеток ^1, миогенные стволовых клеток ^2,3. В естественных условиях эти клетки существуют в состоянии покоя обратимо, расположенной между сарколеммы и базальной пластинки каждого myofibre, но активируются к пролиферации, предохранитель и дифференцировать как мышечная ткань повреждена, ремонт и регенерируется ^3. Спутниковые клетки могут быть выделены из молодых и пожилых человек мышечных биоптатов с использованием ферментативного расщепления ⁴ и их миогенными свойств может затем быть изучены в первичной культуре ^5. Эффективность этого процесса изоляции в отношении как выхода и чистоты популяции клеток зависит от используемых методов и может меняться от образца к образцу. Два основных прилипшие типы клеток, полученные из ферментативного расщепления являются клетки-сателлиты (в настоящее время называются миогенные клетки или клетки предшественников мышечных волокон), которые были определены первоначально как CD56 ⁺ / Desmin клеток и муSCLE полученных фибробласты, идентифицированные как CD56 ^– и TE7 ⁺ клеток ^5. Фибробласты имеют быстрый темп пролиферации и не подвергаются необратимому остановку роста и терминальной дифференцировки на межклеточных контактов как миогенных клеток; Таким образом, в смешанных популяциях, фибробласты могут захватить миогенные клетки доминируют в культуре.

Фибробласты часто рассматривается как раздражение для мышц биологов, однако, в настоящее время растет интерес к фибробластов клетки, достойных изучения в их собственном праве, в частности, как они были показаны иметь кооперативную роль миогенных клеток во время мышечной ремонта ⁶ , Выделение и очистка из различных типов клеток из человеческой мышцы, таким образом, важным фактором методической при попытке исследовать врожденной поведение обоих типов клеток в культуре. Флуоресценции активированных сортировки клеток (FACS) представляет собой способ, при котором клетки могут быть отсортированы для дальнейшего изучения и / или подсчитывали ианализируются. FACS, как было показано, чтобы надежно обогатить миогенные клетки человека, но выход клеток для последующей культуры до сих пор не была высокой ^7. Учитывая ограниченный потенциал репликации соматических клеток, таких как сателлитных клеток, полученных из миогенных клеток и очень плохом пролиферации и дифференцировки, связанных со старением ^4, более нежные подходы. Холост культуры мышечных волокон предложить другой, менее агрессивны, средства получения мышиных клетки-сателлиты по-прежнему проживают в их sublaminal нише и после их активации в культуре ^8,9. Тем не менее, это часто не представляется возможным из человеческой мышечной биопсии материала (из-за волокна редко могут быть получены из сухожилия к сухожилия), что означает, что этот метод не может быть доступным для многих исследовательских лабораторий, заинтересованных в изучении мышечных клеток, полученных человека. Кроме того, единая методика только волокна обеспечивает очень ограниченное число клеток.

Здесь мы опишем систему сортировки, основанный на генTLE ферментативное расщепление клеток с использованием коллагеназы и диспазу в сопровождении двух последовательных раундов магнитного активированного сортировки клеток (MACS), которая дает как высокую чистоту (> 95% миогенные клетки) и выход (~ 2,8 х 10 ⁶ ± 8,87 х 10 ⁵ клеток / г ткани) для экспериментов в области культуры. CD56 считается золотым стандартом поверхностным маркером для идентификации клеток-сателлитов человека в месте ¹⁰ и в пробирке ¹¹ и обеспечивает идеальный кандидат поверхностный маркер для крепления борта. При таком подходе CD56 антитела, конъюгированного с оксидом железа и полисахарида, содержащего суперпарамагнитные шарики связаны с клетками и пропускают через высокий градиент магнитного разделительной колонны клеток, помещенной в сильном магнитном поле ^12,13. В разделительные колонны заполнены с матрицей ферромагнитных стали шерсти или железа сферах, которые служат, чтобы сосредоточиться силовых линий магнитного поля к их поверхности, генерирующих сильные градиенты магнитного поля (~ 4tesla) ¹⁴, В этих колонн даже несколько магнитных клетки притягиваются и адсорбируют на своей поверхности ^14. Unbound (CD56 ^-) клетки проходят через колонку, тогда как CD56 ⁺ клетки, помеченные магнитных микросфер, сохраняются до удаления от магнитного поля ^12,15.

Клеточные суспензии из любой стадии процесса сортировки можно покрыть при желаемой плотности для дальнейших экспериментов. После данного вмешательства клеточные компоненты могут быть определены с помощью иммуноцитохимии, отображаемого использованием широкого поля или конфокальной флуоресцентной микроскопии и количественный анализ с использованием подхода, анализа изображений, что позволяет быстро объективное измерение всех меченых клеток в той или иной образ. В нашей лаборатории мы использовали этот двоякий подход иммуномагнитный сортировки с последующим анализом изображений ^16, чтобы продемонстрировать, что CD56 ^– фибробласты человека легко трансформироваться в адипоциты, в то время как миогенной клеткис спутниковой происхождения обладают высокой устойчивостью к этой адипогенной преобразования ^5.