العزلة والكمية Immunocytochemical توصيف الخلايا عضلي الابتدائية والخلايا الليفية من العضلات الهيكلية البشرية
Summary
The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.
Abstract
إصلاح وتجديد العضلات والهيكل العظمي يتطلب العمل من الخلايا الأقمار الصناعية، والتي هي الخلايا الجذعية العضلية المقيمين. هذه يمكن أن تكون معزولة من عينات خزعة العضلات الإنسان باستخدام الهضم الأنزيمي وممتلكاتهم المنشأ العضلي درس في الثقافة. كميا، وهما أنواع الخلايا الملتصقة الرئيسية التي تم الحصول عليها من عملية الهضم الأنزيمي هي: (أ) الخلايا الأقمار الصناعية (وهو ما يسمى خلايا المنشأ العضلي أو خلايا السلائف العضلات)، التي تم تحديدها في البداية كما CD56 + CD56 وفيما بعد + / + desmin خلايا و (ثانيا) muscle- الليفية المشتقة ويدعى CD56 – وTE-7 +. الليفية تتكاثر بشكل فعال جدا في الثقافة والسكان الخلية المختلطة هذه الخلايا قد تجاوز خلايا المنشأ العضلي للهيمنة على الثقافة. عزل وتنقية من أنواع مختلفة من الخلايا من العضلات الإنسان تشكل بالتالي اعتبار المنهجي المهم عند محاولة للتحقيق في السلوك الفطري إما نوع من الخلايا في الثقافة. نحن هنا أن descrالمكتب الدولي للتربية نظام الفرز على أساس الهضم الأنزيمي لطيف من الخلايا باستخدام كولاجيناز وdispase تليها المغناطيسية خلية تنشيط الفرز (MACS) الذي يعطي كل من نقاء عالية (> خلايا المنشأ العضلي 95٪) والعائد الجيد (~ 2.8 × 10 6 ± 8.87 5 × 10 خلية / ز الأنسجة بعد 7 أيام في المختبر) للتجارب في الثقافة. ويستند هذا النهج على احتضان مختلطة السكان خلية مأخوذة من العضلات مع ميكروبيدات المغناطيسية الخرز مترافق إلى الأجسام المضادة ضد CD56 ومن ثم تمرير الخلايا على الرغم من مجال مغناطيسي. يتم الاحتفاظ CD56 + الخلايا بد أن ميكروبيدات حسب الحقل في حين CD56 – خلايا تمر دون عوائق من خلال العمود. تعليق خلية من أي مرحلة من مراحل عملية الفرز يمكن مطلي ومثقف. وبعد تدخل معين، مورفولوجيا الخلايا، والتعبير وتوطين البروتينات بما في ذلك عوامل النسخ النووية يمكن قياسها كميا باستخدام الوسم مناعي مع الاجسام المضادة المحددة وصورة عو rocessing وحزمة التحليل.
Introduction
إصلاح وتجديد العضلات والهيكل العظمي يتطلب العمل من الخلايا الأقمار الصناعية 1، والخلايا الجذعية المنشأ العضلي 2،3. في الجسم الحي وتوجد هذه الخلايا في حالة هادئة عكسية تقع بين غمد الليف العضلي والصفيحة القاعدية من كل myofibre، ولكن تصبح تنشيط لتتكاثر، تلف الصمامات وتفرق كما الأنسجة العضلية، وإصلاح وإعادة إنشاء 3. الخلايا الأقمار الصناعية يمكن أن تكون معزولة من الشباب والمسنين عضلات الإنسان عينات الخزعة باستخدام الهضم الأنزيمي 4 وممتلكاتهم المنشأ العضلي يمكن بعد ذلك أن تدرس في الثقافة الابتدائية 5. كفاءة هذه العملية بمعزل فيما يتعلق بكل من المحصول ونقاء السكان الخلية تعتمد على الأساليب المستخدمة، ويمكن أن تختلف من عينة لعينة. أنواع الخلايا اثنين الرئيسية ملتصقة تم الحصول عليها من عملية الهضم الأنزيمي هي الخلايا الأقمار الصناعية (خلايا المنشأ العضلي يطلق عليه الآن أو خلايا السلائف العضلات)، التي تم تحديدها في البداية باعتبارها خلايا CD56 + / desmin، وموالليفية المستمدة scle ويدعى CD56 – وTE7 + 5 خلايا. الليفية لديها معدل التكاثري السريع ولا تخضع اعتقال النمو لا رجعة فيه والتمايز النهائي على اتصال خلية خلية مثل خلايا المنشأ العضلي. وبالتالي في المختلطة السكان، قد تجاوز الخلايا الليفية خلايا المنشأ العضلي للهيمنة على الثقافة.
وغالبا ما كان ينظر الليفية باعتبارها تهيج لعلماء الأحياء العضلات، ومع ذلك، هناك الآن اهتماما متزايدا في الخلايا الليفية إلى خلايا تستحق الدراسة في حد ذاتها، لا سيما وقد ثبت أنها ليكون لها دور تعاوني مع خلايا المنشأ العضلي خلال إصلاح العضلات 6 . عزل وتنقية من أنواع مختلفة من الخلايا من العضلات الإنسان تشكل بالتالي اعتبار المنهجي المهم عند محاولة للتحقيق في السلوك الفطري لكل من أنواع الخلايا في الثقافة. مضان تنشيط الخلايا الفرز (FACS) هو الطريقة التي يمكن فرز الخلايا لمزيد من الدراسة و / أو عدها وتحليل. وقد تبين FACS لإثراء موثوق خلايا المنشأ العضلي الإنسان، ولكن لم يكن العائد من الخلايا للثقافة اللاحقة حتى الآن 7 عالية. نظرا لإمكانية تكرار محدودة من الخلايا الجسدية مثل الخلايا المشتقة خلايا المنشأ العضلي الأقمار الصناعية وانتشار سيئة للغاية والتمايز المرتبطة الشيخوخة 4، ثمة حاجة إلى نهج أكثر لطيف. ثقافات الألياف العضلية واحدة تقدم آخر، أقل عدوانية، يعني الحصول على الخلايا الأقمار الصناعية الفئران لا يزال مقيما في مكانها المناسب sublaminal وبعد تفعيلها في الثقافة 8،9. ومع ذلك، وهذا هو في كثير من الأحيان غير ممكن من الإنسان المواد خزعة العضلات (لأن الألياف نادرا ما يمكن الحصول عليه من وتر إلى وتر) وهذا يعني أن هذه التقنية قد لا تكون في متناول العديد من مختبرات الأبحاث المهتمة في دراسة الخلايا المشتقة من عضلات الإنسان. وعلاوة على ذلك، فإن تقنية الألياف واحدة لا يوفر سوى أعداد الخلايا محدودة للغاية.
نحن هنا وصف نظام الفرز على أساس جنرالالهضم الأنزيمي TLE من الخلايا باستخدام كولاجيناز وdispase تليها اثنين جولات متتالية من خلية تنشيط المغناطيسية الفرز (MACS) الذي يعطي كل من نقاء عالية (> 95٪ خلايا المنشأ العضلي) والعائد (~ 2.8 × 10 6 ± 8.87 × 10 5 خلايا / ز الأنسجة) للتجارب في الثقافة. ويعتبر CD56 الذهب علامة سطح القياسية لتحديد الخلايا الأقمار الصناعية الإنسان في الموقع 10 و 11 في المختبر، ويوفر المثالي سطح مرشح علامة لمرفق حبة. في هذا النهج الأجسام المضادة CD56 مترافق إلى أكسيد الحديد وملزمة الخرز مغنطيسية مسايرة فائقة superparamagnetic التي تحتوي على السكاريد إلى الخلايا ومرت عالية التدرج عمود فصل الخلية المغناطيسي وضعها في مجال مغناطيسي قوي 12،13. تمتلئ الأعمدة الفصل مع مصفوفة من المغناطيسية الصوف الصلب أو الحديد المجالات التي تعمل على تركيز خطوط المجال المغناطيسي نحو سطحها توليد التدرجات حقل مغناطيسي قوي (~ 4tesla) 14. في هذه الأعمدة تنجذب حتى الخلايا المغناطيسية قليلا، وكثف إلى سطحها 14. غير منضم (CD56 -) خلايا تمر عبر عمود في حين يتم الاحتفاظ CD56 + الخلايا المسمى مع ميكروبيدات المغناطيسية حتى إزالة من الحقل المغناطيسي 12،15.
تعليق خلية من أي مرحلة من مراحل عملية الفرز يمكن مطلي في كثافة المطلوب لمزيد من التجارب. وبعد تدخل معين يمكن التعرف على المكونات الخلوية باستخدام مناعية، تصوير باستخدام واسعة المجال أو متحد البؤر المجهري مضان وتحليلها كميا باستخدام نهج تحليل الصور التي تسمح القياس الموضوعي السريع لجميع الخلايا المسمى في أي صورة معينة. في مختبرنا وقد استخدمنا هذا النهج الفرز immunomagnetic مزدوج تليها تحليل الصور 16 إلى إثبات أن CD56 – الخلايا الليفية الإنسان تحورها بسهولة في الخلايا الشحمية، في حين خلية المنشأ العضليالصورة الأصلية الأقمار الصناعية هي شديدة المقاومة لهذا التحويل مكون الشحم 5.
Protocol
Representative Results
Discussion
وصفناها إجراء فرز immunomagentic لتخصيب انتقائية السلائف مأخوذة من العضلات البشرية من عينات صغيرة من المواد خزعة العضلات. وكانت هذه التقنية لا تقدر بثمن في مختبرنا للتغلب على فقدان الثقافات مأخوذة من العضلات الإنسان إلى الخلايا الليفية، ولكن أيضا لفهم سلوك فريد من السكان …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors wish to thank Carl Hobbs and Lindsey Majoram for their technical assistance, and Professor Pat Doherty for use of microscopy facilities. Dr. Agley was supported by a studentship from King’s College London. Funding from the Spurrell Trust is also acknowledged.
Materials
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| Dispase II | Sigma | D4693-1G | Must be filter sterilized before use |
| Trypsin/EDTA | (Gibco) Invitrogen | 15400-054 | |
| 100 micron cell strainer | BD Biosciences | 352360 | |
| Collagen solution ( 3 mg/ml in 0.1% acetic acid) | Sigma, Dorset, UK | C8919 | |
| Minisart SRP15 syringe filter (0.2 micron) | Sartorius | 17573ACK | Polytetrafluorethylene (PTFE) membrane |
| CD56 human Microbeads | Miltenyi Biotech | 130-050-401 | Be aware of the limited shelf life of microbeads |
| Anti- fibroblast Microbeads, human | Miltenyi Biotech | 130-050-601 | |
| 40 μm Pre-separation filters | Miltenyi Biotech | 130-041-407 | |
| Large Cell Collumns | Miltenyi Biotech | 130-042-202 | These columns come with a flow resistor. Use of the flow resistor is not necessary to obtain the high myogenic purities described here. |
| LS columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| MiniMacs Seperator | Miltenyi Biotech | 130-042-102 | This separator fits the large cell column but not the LS column. |
| MidiMACS | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| MACS multistand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| BSA | Sigma | Must be filter sterilized before use | |
| Oil Red O | Sigma | O0625 | |
| Triethyl phosphate | Sigma | 538728 | |
| Whatman Paper | Sigma | Z241121-1PAK | No. 42, Ashless. To prepare the filter fold the circular filter paper to make a semi circle, then fold the semi-circle in half again to form a cone shape. Fit the cone into a funnel for filtering. |
| ProLong Gold Antifade Reagent | Molecular Probes, Invitrogen | P36930 | This can be purchased with or without DAPI and does not quench initial fluorescence. |
| AxioVision | Carl Zeiss | Contact Zeiss | |
| Adobe Photoshop CS5 Extended | Adobe (purchased from Pugh Computers) | ADPH16982* |
References
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibres. J. Cell Biol. 9, 493-495 (1961).
- Hawke, T. J., Garry, D. J. Myogenic satellite cells: physiology to molecular biology. J. Appl. Physiol. 91, 534-551 (2001).
- Yin, H., Price, F., Rudnicki, M. A. Satellite Cells and the Muscle Stem Cell Niche. Physiol. Rev. 93, 23-67 (2013).
- Alsharidah, M., et al. Primary human muscle precursor cells obtained from young and old donors produce similar proliferative, differentiation and senescent profiles in culture. Aging Cell. 12, 333-344 (2013).
- Agley, C. C., Rowlerson, A. M., Velloso, C. P., Lazarus, N. R., Harridge, S. D. R. Human skeletal muscle fibroblasts, but not myogenic cells, readily undergo adipogenic differentiation. J. Cell Sci. 126, 5610-5625 (2013).
- Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration. Development. 138, 3625-3637 (2011).
- Webster, C., Pavlath, G. K., Parks, D. R., Walsh, F. S., Blau, H. M. Isolation of human myoblasts with the fluorescence-activated cell sorter. Exp. Cell Res. 174, 252-265 (1988).
- Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle. J. Vis Exp. , e50074 (2013).
- Kuang, S., Kuroda, K., Le Grand, F., Rudnicki, M. A. Asymmetric Self-Renewal and Commitment of Satellite Stem Cells in Muscle. Cell. 129, 999-1010 (2007).
- Mackey, A. L., et al. Assessment of satellite cell number and activity status in human skeletal muscle biopsies. Muscle a d Nerve. 40, 455-465 (2009).
- Stewart, J. D., et al. Characterization of proliferating human skeletal muscle-derived cells in vitro: Differential modulation of myoblast markers by TGF-β2. J. Cell. Physiol. 196, 70-78 (2003).
- Miltenyi, S., Müller, W., Weichel, W., Radbruch, A. High gradient magnetic cell separation with MACS. Cytometry. 11, 231-238 (1990).
- Clarke, C., Davies, S., Brooks, S. A., Schumacher, U. Ch. 2. Methods in Molecular Medicine. Metastasis Research Protocols. 58, 17-23 (2001).
- Grützkau, A., Radbruch, A. Small but mighty: How the MACS-technology based on nanosized superparamagnetic particles has helped to analyze the immune system within the last 20 years. Cytometry Part A. 77A, 643-647 (2010).
- Tomlinson, M. J., Tomlinson, S., Yang, X. B., Kirkham, J. Cell separation: Terminology and practical considerations. Journal of Tissue Engineering. 4, (2013).
- Agley, C. C., Velloso, C. P., Lazarus, N. R., Harridge, S. D. R. An Image Analysis Method for the Precise Selection and Quantitation of Fluorescently Labeled Cellular Constituents: Application to the Measurement of Human Muscle Cells in Culture. J. Histochem. Cytochem. 60, 428-438 (2012).
- Danoviz, M., Yablonka-Reuveni, Z., DiMario, J. X. Ch. 2. Methods in Molecular Biology. Myogenesis. 798, 21-52 (2012).
- Bergström, J. Muscle electrolytes in man. Determined by neutron activation analysis on needle biopsy specimens. A study on normal subjects, kidney patients, and patients with chronic diarrhoea. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 14, 7-100 (1962).
- Chazaud, B., et al. Satellite cells attract monocytes and use macrophages as a support to escape apoptosis and enhance muscle growth. The Journal of Cell Biology. 163, 1133-1143 (2003).
- Abou-Khalil, R., et al. Autocrine and Paracrine Angiopoietin 1/Tie-2 Signaling Promotes Muscle Satellite Cell Self-Renewal. Cell Stem Cell. 5, 298-309 (2009).
- Timpl, R., Kvonder Mark, . Role of laminin and fibronectin in selecting myogenic versus fibrogenic cells from skeletal muscle cells in. 117, 628-635 (1986).
- Lichtman, J. W., Conchello, J. -. A. Fluorescence microscopy. Nat Meth. 2, 910-919 (2005).
- Koopman, R., Schaart, G., Hesselink, M. Optimisation of oil red O staining permits combination with immunofluorescence and automated quantification of lipids. Histochem. Cell Biol. 116, 63-68 (2001).
- Rossner, M., Yamada, K. M. What’s in a picture? The temptation of image manipulation. The Journal of Cell Biology. 166, 11-15 (2004).
- Zinchuk, V., Grossenbacher-Zinchuk, O. Recent advances in quantitative colocalization analysis: Focus on neuroscience. Prog. Histochem. Cytochem. 44, 125-172 (2009).
- Johnson, J. Not seeing is not believing: improving the visibility of your fluorescence images. Mol. Biol. Cell. 23, 754-757 (2012).
- Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. The Journal of Cell Biology. 185, 1135-1148 (2009).
- Pawley, J. The 39 steps: A cautionary tale of quantitative 3-D fluorescence microscopy. Biotechniques. 28, 884-887 (2000).
- Bolte, S., Cordelières, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. J. Microsc. 224, 213-232 (2006).
- Brown, C. M. Fluorescence microscopy – avoiding the pitfalls. J. Cell Sci. 120, 1703-1705 (2007).
- Bareja, A., et al. Human and Mouse Skeletal Muscle Stem Cells: Convergent and Divergent Mechanisms of Myogenesis. PLoS ONE. 9, e90398 (2014).
- Castiglioni, A., et al. Isolation of Progenitors that Exhibit Myogenic/Osteogenic Bipotency In by Fluorescence-Activated Cell Sorting from Human Fetal Muscle. Stem Cell Reports. 2, 560 (2014).
- Fukada, S. -. i., et al. CD90-positive cells, an additional cell population, produce laminin α2 upon transplantation to dy3k/dy3k mice. Exp. Cell Res. 314, 193-203 (2008).
- Stickland, N. Muscle development in the human fetus as exemplified by m. sartorius: a quantitative study. J. Anat. 132, 557-579 (1981).
