The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.
La riparazione e rigenerazione del muscolo scheletrico richiede l'azione di cellule satelliti, che sono le cellule staminali muscolari residente. Questi possono essere isolati da campioni di biopsia muscolare umana utilizzando la digestione enzimatica e le loro proprietà miogenici studiate in cultura. Quantitativamente, i due principali tipi di cellule aderenti ottenuti dalla digestione enzimatica sono: (i) le cellule satellite (chiamate cellule miogeniche o cellule precursori del muscolo), identificato inizialmente come CD56 + e poi come + desmina + cellule CD56 / e (ii) muscolo- fibroblasti derivati, identificati come CD56 – e TE-7 +. I fibroblasti proliferano molto efficiente in cultura e in popolazioni di cellule miste queste cellule possono invadere le cellule miogeniche a dominare la cultura. L'isolamento e purificazione di diversi tipi di cellule di muscolo umano è quindi un importante considerazione metodologica quando si cerca di studiare il comportamento innata di entrambi i tipi di cellule in coltura. Qui DESCRIBE un sistema di ordinamento basata sulla digestione enzimatica delicata delle cellule usando collagenasi e dispasi seguita da magnetico cellule attivate classificare (MACS) che fornisce sia una purezza elevata (> cellule miogeniche 95%) e buona resa (~ 2,8 x 10 6 ± 8.87 x 10 5 cellule / g di tessuto dopo 7 giorni in vitro) per esperimenti in coltura. Questo approccio si basa sul incubando la popolazione mista di cellule derivate muscolare con microsfere magnetiche microsfere coniugate ad un anticorpo contro CD56 e poi passando cellule se un campo magnetico. CD56 + cellule legate a microsfere sono conservati dal campo, mentre CD56 – le cellule passano senza impedimenti attraverso la colonna. Le sospensioni cellulari da qualsiasi fase del processo di selezione possono essere placcati e colto. Dopo un determinato intervento, morfologia cellulare, e l'espressione e la localizzazione delle proteine compresi fattori di trascrizione nucleare può essere quantificato utilizzando etichettatura immunofluorescenza con anticorpi specifici e un'immagine processing e pacchetto di analisi.
La riparazione e la rigenerazione del muscolo scheletrico richiede l'azione delle cellule satelliti 1, le cellule staminali miogeniche 2,3. In vivo esistono queste cellule in uno stato di quiescenza reversibilmente situato tra il sarcolemma e la lamina basale di ogni myofibre, ma si attivano a proliferare, fusibile e differenziare in tessuto muscolare è danneggiato, riparati e rigenerati 3. Le cellule satelliti possono essere isolate da biopsie muscolari umane giovani e anziani con la digestione enzimatica 4 e le loro proprietà miogenici può essere successivamente studiato in colture primarie 5. L'efficienza di questo processo di isolamento per quanto riguarda sia la resa e la purezza della popolazione cellulare dipende dai metodi utilizzati e può variare da campione a campione. I due principali tipi di cellule aderenti ottenuti dalla digestione enzimatica sono le cellule satelliti (cellule miogeniche ora chiamati o cellule precursori del muscolo), identificato inizialmente come cellule CD56 + / desmina e mufibroblasti SCLE-derivati, identificati come CD56 – e TE7 + 5 celle. I fibroblasti hanno un tasso di proliferazione rapida e non subiscono irreversibile arresto della crescita e differenziazione terminale al contatto cellula-cellula come le cellule miogeniche; quindi in popolazioni miste, fibroblasti possono overrun cellule miogeniche a dominare la cultura.
I fibroblasti sono stati spesso visti come un fastidio per i biologi muscolari, tuttavia, vi è ora un crescente interesse in fibroblasti da cellule degni di studio e propri, in particolare per quanto essi hanno dimostrato di avere un ruolo di collaborazione con cellule miogeniche durante la riparazione del muscolo 6 . L'isolamento e purificazione di diversi tipi di cellule di muscolo umano è quindi un importante considerazione metodologica quando si cerca di studiare il comportamento innata di entrambi i tipi di cellule in coltura. Fluorescence-activated cell sorting (FACS) è un metodo con cui le cellule possono essere ordinati per ulteriori studi e / o contati eanalizzati. FACS è stato dimostrato per arricchire affidabile cellule miogeniche umane, ma la resa di cellule per la coltura successiva non è stata finora alta 7. Dato il potenziale di replica limitato di cellule somatiche come le cellule satellite cellule derivate miogenici e più poveri proliferazione e differenziamento associati senescenza 4, sono necessari approcci più dolci. Culture fibre muscolari singole offrono un altro, meno aggressivo, mezzi per ottenere cellule satelliti murine ancora residente nella loro nicchia sublaminal e dopo la loro attivazione in cultura 8,9. Tuttavia, questo non è spesso possibile dal materiale bioptico muscolo umano (perché fibre possono raramente essere ottenuti da tendine tendine) significa che questa tecnica non può essere accessibile a molti laboratori di ricerca interessati a studiare cellule derivate muscolari umane. Inoltre, la tecnica singola fibra fornisce solo il numero di cellule molto limitato.
Qui si descrive un sistema di ordinamento basato sulla genTLE digestione enzimatica delle cellule usando collagenasi e dispasi seguita da due successivi cicli di cellule attivate magnetica smistamento (MACS) che fornisce sia una purezza elevata (> 95% di cellule miogeniche) e la resa (~ 2,8 x 10 6 ± 8,87 x 10 5 cellule / g di tessuto) per esperimenti in coltura. CD56 è considerato il marcatore di superficie gold standard per l'identificazione delle cellule satelliti umane in situ 10 e in vitro 11 e fornisce la superficie ideale marcatore candidato per il fissaggio tallone. In questo approccio anticorpi CD56 coniugati ad ossido di ferro e-polisaccaride contenente microsfere superparamagnetiche sono vincolati alle cellule e passato attraverso un alto gradiente colonna di separazione cellulare magnetica posto in un forte campo magnetico 12,13. Le colonne di separazione sono riempiti con una matrice di lana di acciaio o ferro sfere ferromagnetiche che servono a concentrare le linee del campo magnetico verso la superficie generano forti gradienti di campo magnetico (~ 4tesla) 14. In queste colonne cellule leggermente magnetici anche sono attratti e assorbiti alla loro superficie 14. Unbound (CD56 -), le cellule passano attraverso la colonna, mentre CD56 + cellule marcate con microsfere magnetiche vengono mantenuti fino rimozione dal campo magnetico 12,15.
Le sospensioni cellulari da qualsiasi fase del processo di sequenziazione possono essere placcati alla densità desiderata per ulteriori sperimentazioni. A seguito di un determinato intervento dei costituenti cellulari possono essere identificati mediante immunocitochimica, ripreso con grande campo o la microscopia confocale e analizzati quantitativamente usando un approccio di analisi delle immagini che permette una rapida misurazione oggettiva di tutte le cellule marcate in ogni immagine data. Nel nostro laboratorio abbiamo usato questo doppio approccio ordinamento immunomagnetica seguita da analisi di immagine 16 per dimostrare che CD56 – fibroblasti umani prontamente transdifferenziarsi in adipociti, mentre cellulare miogenicos di origine satellite sono altamente resistenti a questa conversione adipogenico 5.
Abbiamo descritto un procedimento di ordinamento immunomagentic per l'arricchimento selettivo di precursori derivato muscolari umani da piccoli campioni di materiale biopsia muscolare. Questa tecnica è stato prezioso nel nostro laboratorio per superare la perdita di colture derivate muscolari fibroblasti umani, ma anche per comprendere il comportamento unica di distinte popolazioni di progenitori derivato muscolari. Cellule miogeniche Una volta purificate possono essere indagati per le modifiche delle proteine ?…
The authors have nothing to disclose.
The authors wish to thank Carl Hobbs and Lindsey Majoram for their technical assistance, and Professor Pat Doherty for use of microscopy facilities. Dr. Agley was supported by a studentship from King’s College London. Funding from the Spurrell Trust is also acknowledged.
Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
Dispase II | Sigma | D4693-1G | Must be filter sterilized before use |
Trypsin/EDTA | (Gibco) Invitrogen | 15400-054 | |
100 micron cell strainer | BD Biosciences | 352360 | |
Collagen solution ( 3 mg/ml in 0.1% acetic acid) | Sigma, Dorset, UK | C8919 | |
Minisart SRP15 syringe filter (0.2 micron) | Sartorius | 17573ACK | Polytetrafluorethylene (PTFE) membrane |
CD56 human Microbeads | Miltenyi Biotech | 130-050-401 | Be aware of the limited shelf life of microbeads |
Anti- fibroblast Microbeads, human | Miltenyi Biotech | 130-050-601 | |
40 μm Pre-separation filters | Miltenyi Biotech | 130-041-407 | |
Large Cell Collumns | Miltenyi Biotech | 130-042-202 | These columns come with a flow resistor. Use of the flow resistor is not necessary to obtain the high myogenic purities described here. |
LS columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
MiniMacs Seperator | Miltenyi Biotech | 130-042-102 | This separator fits the large cell column but not the LS column. |
MidiMACS | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
MACS multistand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
BSA | Sigma | Must be filter sterilized before use | |
Oil Red O | Sigma | O0625 | |
Triethyl phosphate | Sigma | 538728 | |
Whatman Paper | Sigma | Z241121-1PAK | No. 42, Ashless. To prepare the filter fold the circular filter paper to make a semi circle, then fold the semi-circle in half again to form a cone shape. Fit the cone into a funnel for filtering. |
ProLong Gold Antifade Reagent | Molecular Probes, Invitrogen | P36930 | This can be purchased with or without DAPI and does not quench initial fluorescence. |
AxioVision | Carl Zeiss | Contact Zeiss | |
Adobe Photoshop CS5 Extended | Adobe (purchased from Pugh Computers) | ADPH16982* |