Espressione della proteina ricombinante di Biologia Strutturale in HEK 293F cellule in sospensione: un approccio nuovo e accessibile

NOTA: Il protocollo è adatto a qualsiasi scala di espressione, quindi, i volumi e le quantità di reagenti devono essere scalati in modo proporzionale. Un adatto vettore di espressione di mammifero deve essere utilizzato per questo protocollo. Qui abbiamo utilizzato una versione modificata pcDNA 3.1 vettore di espressione che permette comodamente l'inclusione o l'esclusione di un tag di affinità in base alla scelta degli enzimi di restrizione utilizzati nella clonazione (Figura 1). Il seguente protocollo descrive un grande trasfezione scala. 1 Large Scale Cultura / trasfezione in 1 L Roller Bottiglie Crescere e mantenere le cellule sospensione adattato HEK293F secondo protocolli standard. Tipicamente colture starter comprese tra 30 e 100 ml sono coltivati ​​in 250 ml coniche fiasche di coltura cellulare. Cellule Seed a 0.5 x 10 6 cellule / ml in un volume finale di 300 ml in ogni bottiglia rullo 1 L. NOTA: bottiglie rulli ospitare un minimo di 150 ml ad un massimo di300 ml di coltura in sospensione. Per i più grandi transfezioni scala utilizzare più bottiglie. Incubare per 24 ore in un agitatore orbitale incubatore a 37 ° C, 120 rpm, e 5% di CO 2 fino cellule raggiungono una densità di 1,0 x 10 6 cellule / ml (cellule devono dividere approssimativamente ogni 24 ore). Pipettare un totale di 300 mg di DNA, sterilizzata per filtrazione (vedi metodo supplementare) in 30 ml di PBS e mescolare vigorosamente nel vortex per 3 secondi. NOTA: Utilizzare un totale di 1 mg di DNA per milione di cellule trasfettate. Se due o più plasmidi devono essere co-trasfettate ridurre la quantità di ciascun modo che il rapporto di DNA di cellule rimane costante. Aggiungere 1,2 ml di 0,5 mg / ml, sterilizzata per filtrazione PEI alla soluzione PBS / DNA e vortex vigorosamente per 3 sec. Incubare la miscela a temperatura ambiente per 20 min. Aggiungere il DNA / PEI miscela alle cellule – che dovrebbe essere ad una densità di 1 x 10 6 cellule / ml (passo 1.3). A seguito di co-trasfezione, incubare le cellulein un incubatore agitatore orbitale per un ulteriore 48 ore a 37 ° C, 120 rpm, e 5% di CO 2. Harvest proteine ​​intracellulari mediante centrifugazione cellule a 3.000 xg per 5 min e immagazzinare il pellet a -80 ° C. NOTA: In alternativa, usare uno standard (non-CO 2) che agita incubatrice, se l'atmosfera sopra la coltura viene sostituito con il 5% di CO 2 e il coperchio della bottiglia è sigillata. L'atmosfera dovrà essere sostituita ad ogni passaggio (normalmente ogni 2 giorni). 2.-Protein complesso Purificazione da estratto cellulare totale Questo protocollo è ottimizzato per la purificazione dei complessi nucleari che utilizzano proteine ​​bandiera-tag. Scongelare pellet di cellule in ~ 40 ml di tampone di lisi pre-raffreddata (100 mM acetato di potassio, 50 mM Tris pH 7,5, 5% glicerolo, 0,3% Triton X-100, inibitori della proteasi) per l di cultura. Risospendere il pellet pipettando su e giù parecchie volte (per evitare la formazione di schiuma, non fare vortex). </li> Accuratamente risospendere le cellule utilizzando un omogeneizzatore di vetro. Sonicare per 3 cicli (15 sec a 15 sec, off). Centrifugare a 30.000 xg per 25 min a 4 ° C e conservare il surnatante. Equilibrare 1,25 ml di anti-bandiera ricco di resina di agarosio per litro di coltura da lavare tre volte con tampone di equilibrazione resina (acetato di potassio 100 mM, 50 mM Tris pH 7.5). Incubare l'estratto cellulare tutto dal punto 2.3 con la resina di affinità in uno o più di 50 ml provette e ruotare delicatamente il campione per 30-120 minuti a 4 ° C. Centrifugare a 3000 xg per 1 min a 4 ° C, il surnatante scarti. Lavare la resina con 45 ml di tampone di pre-refrigerati 1 (100 mM acetato di potassio, 50 mM Tris pH 7,5, 5% glicerolo, 0,3% Triton X-100). Centrifugare a 3000 xg per 1 minuto e scartare il surnatante. Ripetere il punto 2.7 utilizzando tampone di sale (acetato di potassio 300 mM, 50 mM Tris pH 7,5, 5% glicerolo), seguito da buffer di basso contenuto di sale (acetato di potassio 50 mM, 50 mM Tris pH 7.5, 5% glicerolo) e TEV Decolleté Buffer (50 mM acetato di potassio, 50 mM Tris pH 7.5, TCEP 0,5 mM). NOTA: Assicurarsi che ogni lavaggio è breve cioè, sufficiente a pieno risospendere la resina e non più. Raccogliere un campione di 10 ml di resina e diluire in 1 volume di 2x tampone di proteine ​​di carico per l'analisi (controllo legato alle proteine). Non utilizzare agenti riducenti al fine di evitare di rilasciare l'anticorpo dalla resina. Risospendere la resina in 8-10 ml di pre-raffreddata buffer di TEV scissione e trasferimento in una provetta da centrifuga 15 ml. Aggiungere ~ 40 mcg di TEV proteasi (da magazzino a 1 mg / ml) per L di cultura originale e mescolare bene pipettando su e giù parecchie volte. Sostituire atmosfera tubo con il 100% di N 2 gas per prevenire l'ossidazione delle proteine. Ruotare delicatamente O / N a 4 ° C. Centrifugare a 3000 xg per 10 min. Trasferire il surnatante in un filtro ultra centrifugo con un adeguato peso molecolare di cut-off e concentrarsifino a 500 microlitri. Raccogliere un campione di 10 microlitri della proteina concentrato e diluire a 1 volume di tampone 2x proteina caricamento per analisi. (TEV controllo eluato). Raccogliere un campione di 10 ml di resina e diluire a 1 volume di tampone 2x proteina caricamento per analisi. Non utilizzare agenti riducenti per evitare rilasciando grandi quantità di anticorpi dalla resina. (Controllo di resina post-TEV). Equilibrare la colonna cromatografia ad esclusione dimensioni, con buffer di gel filtrazione (acetato di potassio 50 mM, 50 mM Tris pH 7.5, TCEP 0,5 mM). Filtrare la proteina attraverso un filtro da 0,22 micron Caricare il campione nella colonna e raccogliere le frazioni. Campioni Eseguire passi da 2.9, 2.15 e 2.16 e le frazioni di filtrazione gel dal punto 2.19 su un SDS-PAGE e colorazione Coomassie per l'analisi. NOTA: Si consiglia di eseguire un SDS-PAGE di campioni da gradini 2.9, 2.15 e 2.16 prima di gel filtrazione per confermare espressione della proteina bersaglio.