Recombinante eiwitexpressie voor Structurele Biologie in HEK 293F Suspension cellen: een nieuwe en toegankelijke aanpak

OPMERKING: Het protocol is geschikt voor elke schaal van meningsuiting, dus volumes en hoeveelheden reagentia moeten proportioneel worden geschaald. Een geschikte zoogdierlijke expressievector worden gebruikt voor dit protocol. Hier gebruikten we een gemodificeerde pcDNA 3.1 expressievector die gemakkelijk kan de niet opnemen van een affiniteit tag afhankelijk van de keuze van restrictie-enzymen die bij de klonering (Figuur 1). Het volgende protocol beschrijft een grootschalig transfectie. 1 Large Scale Cultuur / Transfection in 1 L Roller Flessen Groei en onderhouden HEK293F-suspensie aangepaste cellen volgens standaard protocollen. Typisch starter cultures van 30 tot 100 ml worden gekweekt in 250 ml konische celkweekkolven. Zaadcellen 0.5 x 10 6 cellen / ml in een uiteindelijk volume van 300 ml per 1 L rolfles. OPMERKING: Rolflessen geschikt minste 150 ml tot maximaal300 ml suspensie cultuur. Voor grotere schaal transfecties gebruik van meerdere flessen. Incubeer gedurende 24 uur in een orbitale schudder incubator bij 37 ° C, 120 rpm en 5% CO2 totdat de cellen een dichtheid van 1,0 x 10 6 cellen / ml bereikt (cellen ongeveer om de 24 uur verdelen). Pipetteer een totaal van 300 ug van DNA-filter gesteriliseerde (zie aanvullende methode) in 30 ml PBS en vortex krachtig gedurende 3 sec. OPMERKING: Gebruik een totaal van 1 ug DNA per miljoen getransfecteerde cellen. Indien twee of meer plasmiden worden geco-transfecteerd vermindering van de hoeveelheid van elk zodat de verhouding van DNA aan cellen constant blijft. Voeg 1,2 ml van 0,5 mg / ml filter-gesteriliseerd PEI de PBS / DNA-oplossing en vortex krachtig gedurende 3 sec. Incubeer het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten. Voeg de DNA / PEI mixen om de cellen – die moet worden bij een dichtheid van 1 x 10 6 cellen / ml (stap 1.3). Na co-transfectie Incubeer de cellenin een orbitale schudder incubator voor een verdere 48 uur bij 37 ° C, 120 rpm en 5% CO2. Harvest intracellulaire proteïnen door centrifugeren cellen bij 3000 g gedurende 5 min en bewaar de pellet bij -80 ° C. OPMERKING: U een standaard (niet-CO2) schudincubator, indien de atmosfeer boven de kweek wordt vervangen door 5% CO2 en het deksel fles werd afgesloten. De atmosfeer moet worden vervangen bij elke passage (gewoonlijk om de 2 dagen). 2 eiwit-complex Zuivering van Whole Cell Extract Dit protocol is geoptimaliseerd voor de zuivering van nucleaire complexen met vlag gemerkte eiwitten. Ontdooi celpellet in ~ 40 ml voorgekoeld lysis buffer (100 mM kaliumacetaat, 50 mM Tris pH 7,5, 5% glycerol, 0,3% Triton X-100, proteaseremmers) per L cultuur. Re-schorten de pellet door en neer te pipetteren meerdere malen (ter voorkoming van schuimvorming, niet vortex). </li> Grondig opnieuw te schorten cellen met behulp van een glazen homogenisator. Ultrasone trillingen gedurende 3 cycli (15 sec aan, 15 seconden uit). Centrifugeer bij 30.000 xg gedurende 25 min bij 4 ° C en bewaar supernatant. Equilibreer 1,25 ml anti-flag verpakt agarose hars per liter kweek door driemaal wassen met hars equilibratiebuffer (100 mM kaliumacetaat, 50 mM Tris pH 7,5). Incubeer de gehele celextract uit stap 2.3 met de affiniteit hars in een of meer 50 ml centrifugebuizen en het monster voorzichtig zwenken 30-120 min bij 4 ° C. Centrifugeer bij 3000 xg gedurende 1 min bij 4 ° C, supernatans. Spoel de hars met 45 ml voorgekoeld 1 buffer (100 mM kaliumacetaat, 50 mM Tris pH 7,5, 5% glycerol, 0,3% Triton X-100). Centrifugeer bij 3000 xg gedurende 1 minuut en gooi supernatant. Herhaal stap 2.7 met hoge zout buffer (300 mM kaliumacetaat, 50 mM Tris pH 7,5, 5% glycerol), gevolgd door lage zout buffer (50 mM kaliumacetaat, 50 mM Tris pH 70,5, 5% glycerol) en TEV Splitsing buffer (50 mM kaliumacetaat, 50 mM Tris pH 7,5, 0,5 mM TCEP). OPMERKING: Zorg ervoor dat elke wasbeurt is kort dus, voldoende om weer volledig op te schorten van de hars en niet langer. Neem een ​​10 gl monster hars en verdun tot 1 volume van 2x eiwitbelading buffer voor analyse (gebonden eiwit control). Gebruik reductiemiddelen gebruiken om te voorkomen los het antilichaam van de hars. Resuspendeer de hars in 8-10 ml voorgekoeld TEV splitsing buffer en overbrengen in een 15 ml centrifugebuis. Voeg ~ 40 ug TEV protease (uit voorraad 1 mg / ml) per L oorspronkelijke cultuur en meng goed door en neer te pipetteren meerdere malen. Vervang buis sfeer met 100% N2 gas aan eiwit oxidatie te voorkomen. Voorzichtig draai O / N bij 4 ° C. Centrifugeer bij 3000 xg gedurende 10 minuten. Breng de bovenstaande in een ultra centrifugaal filter met een geschikt moleculair gewicht cut-off en concentrerentot 500 pi. Neem een ​​10 ul monster van de geconcentreerde proteïneoplossing en verdun tot 1 volume van 2x eiwitbelading buffer voor analyse. (TEV elueren controle). Neem een ​​10 ul monster van de hars en verdun tot 1 volume van 2x eiwitbelading buffer voor analyse. Gebruik reductiemiddelen om te voorkomen uitlaten van grote hoeveelheden antilichaam uit de hars. (Post-TEV hars controle). Equilibreer de size exclusion chromatografie kolom met gelfiltratie buffer (50 mM kaliumacetaat, 50 mM Tris pH 7,5, 0,5 mM TCEP). Filtreer het eiwit door een 0,22 urn filter Plaats het monster in de kolom en het verzamelen van de fracties. Doorgaan monsters van stappen 2.9, 2.15 en 2.16 en gelfiltratie fracties van stap 2.19 op SDS-PAGE en Coomassie kleuring voor analyse. Opmerking: Het is raadzaam om een ​​SDS-PAGE van de monsters lopen van stappen 2.9, 2.15 en 2.16 voor gelfiltratie om expressie van het doeleiwit bevestigen.