HEK 293F懸濁細胞における構造生物学のための組換えタンパク質の発現：小説とアクセアプローチ
Summary
The expression of recombinant proteins by mammalian systems is becoming an attractive method for producing protein complexes for structural biology. Here we present a simple yet highly efficient expression system using suspension grown mammalian cells to purify protein complexes for structural studies.
Abstract
The expression and purification of large amounts of recombinant protein complexes is an essential requirement for structural biology studies. For over two decades, prokaryotic expression systems such as E. coli have dominated the scientific literature over costly and less efficient eukaryotic cell lines. Despite the clear advantage in terms of yields and costs of expressing recombinant proteins in bacteria, the absence of specific co-factors, chaperones and post-translational modifications may cause loss of function, mis-folding and can disrupt protein-protein interactions of certain eukaryotic multi-subunit complexes, surface receptors and secreted proteins. The use of mammalian cell expression systems can address these drawbacks since they provide a eukaryotic expression environment. However, low protein yields and high costs of such methods have until recently limited their use for structural biology. Here we describe a simple and accessible method for expressing and purifying milligram quantities of protein by performing transient transfections of suspension grown HEK (Human Embryonic Kidney) 293F cells.
Introduction
分子細胞生物学の急速な進歩と医療における改善された薬物についての一定の必要性は、構造生物学者は、ますます複雑なタンパク質の構造を見てする必要性を作成しています。これらは、しばしば、その精巧なフォールディングおよび酵素活性をサポートするために特定の翻訳後修飾、分子シャペロン、および補因子を必要とし得る。タンパク質データバンクに存在する構造体の大部分は、細菌発現系を用いて得られている一方で、原核生物は、これらの修飾の多数を実行することができず、多くの必須の真核生物の補因子を欠いている。これは、小さなシグナル伝達分子によってだけでなく、核、細胞表面や精巧な折りたたみ式機械を必要とする分泌タンパク質のために活性化される大きなマルチサブユニット複合体の研究のために問題となることがあります。 Eの数大腸菌株は、これらの制限1のいくつかを克服するように操作されている。 mが、近年では、しかし、使用ammalian発現系は、それらが確実に他のシステム2で表現する他の方法で問題となる真核生物のタンパク質を産生するために増加している。今日では、化学物質媒介トランスフェクション、ウイルス形質導入の範囲のさまざまな技術を通じて安定かつ一過性の哺乳動物発現細胞株を得るために、そのようなエレクトロポレーションおよび直接噴射3のような物理的遺伝子導入が可能である。これらの方法の全ては、長所と短所の独自のセットを有するが、それらのほんの数は、構造研究があまりにも高価および/または時間を消費するのいずれかであるのに適している。
ここでは、非常に、シンプルで高速、安価なまだサスペンション成長し、哺乳動物細胞における構造生物学のためのタンパク質複合体を発現させるための非常に効率的な方法を説明します。アプローチは、ヒト胎児腎臓（HEK）細胞株（ 例えば、フリースタイル、HEK 293F細胞）の一過性同時トランスフェクションを使用しています。これらの細胞は、HEK 293 CEから誘導されているllのラインは、（例えば、フリースタイル293発現培地など）を、無血清培地を用いて高密度に達し、懸濁培養中で増殖するように適合されている。次いで、細胞を一過性ポリエチレンイミン、分枝バージョン（PEI）、エンドサイトーシス5によって宿主細胞に入るDNA / PEI複合体を形成することによって、哺乳動物細胞4の広い範囲のために機能することが報告されている安価なポリマー試薬を用いてトランスフェクトされる。この方法は、（300ミリリットルまで）小規模（30ml）および大規模の両方に適しており、実験および精製されたタンパク質複合体を高レベルで生成することができる。これは、複雑な折り畳み機械、細菌、酵母、および昆虫細胞によって行うことができない補因子、または特定の翻訳後修飾を必要とするタンパク質を研究するために特に有用である。
このプロトコルでは、Sin3A転写抑制複合体からの3タンパク質中央足場の発現および精製を提示する。これはヒストンで構成されていデアセチラーゼ1（HDAC1）、不良サイレン3（SDS3）のサプレッサーおよびスイッチに依存しない3（Sin3A）。精製された複合体は、ハイスループット結晶化試験のために使用される。
Protocol
Representative Results
Discussion
私たちは、哺乳動物細胞から組換えタンパク質及び多サブユニット複合体を大量に発現させ、精製するために（PEIは、市販の親油性のトランスフェクション試薬よりもはるかに少ない費用）簡単かつコスト効果的な方法を開発した。プロトコルセクションに記載したように、高純度のプラスミドDNA（1.8と2.0との間の280分の260）はPEIと組み合わせて使用される場合、最適なトランスフェクションおよび発現効率に達することができる。細胞を血清および抗生物質を含まない培地で培養されなければならないので、滅菌技術は厳密にコストと時間がかかる感染症を避けるために継代し、細胞をトランスフェクトするために必要とされる。細胞の生存率が90％以上でなければならず、文化が2.5×10 6個の細胞よりも大きな密度まで成長させることはありません/すぐにトランスフェクションの前に、そうするように、タンパク質収量が減少しますミリリットル。成功したトランスフェクションのために、培養物を単一または分裂細胞にのみ含まれている必要があります。クラスタは活力によって分割することができるOUはボルテックス20〜30秒（ 図5）。同時トランスフェクションに用いた各プラスミドの比率が研究され、複合体の化学量論に従って、ユーザによって変更することができる。適切な発現時間を確立することができるように、発現効率は、目的のタンパク質に対して最適化することができる。精製は、望ましくないタンパク質分解の危険性を減らすために常時冷たいタンパク質試料を保持行われるべきである。彼らはしばしば減少溶解性および/または酵素活性の損失をもたらす、構造要素または特定のタンパク質の活性部位を妨害することがあるので、タグ及び精製緩衝液の選択は、重要である。小規模トランスフェクションは、大きなタンパク質複合体の精製のための異なる構築物を試験するために特に有用である。
今日では、代わりの方法論の多種多様な組換え真核生物のタンパク質（ 表2）の発現のために利用可能である。たとえば、Baculovi昆虫細胞におけるコーラス発現は広く、その高い形質導入効率および他のウイルス種6と比較して細胞毒性の欠如に使用される。しかし、ウイルスを作製するプロセスは、時間がかかり、その不安定性は、ウイルスが長期間保存することはできません。一方、酵母発現系は、高いタンパク質収率7で得られた、増殖する細胞の発酵槽培養物における非常に高い密度の可能性を提供する。しかし、彼らはまだ、真核生物のタンパク質が正しく折り畳まおよびそれらのタンパク質パートナーと相互作用することに必要な翻訳後修飾の完全な多様性を欠いている。 HDAC3は、例えば、発現されるが、Eにフォールドしない大腸菌 。 293F細胞内で発現した場合しかし、私たちはそのプレッサー（SMRT）および原核細胞には見られない、イノシトール四リン（IP4）8の分子との複合体中の活性酵素を精製することができました。また、このメソッドは、STを精製し、結晶を解決するために私達を許可している同様IP4 9によって活性化されるNuRD複合体でMTA1との相互作用HDAC1のructure。理想的には、私たちは常にその自然、生理的環境における真核生物のタンパク質を表したいと思います。バイオリアクター10-12にHEK 293-EBNA1細胞を用いた哺乳動物発現系が記載およびタンパク質の非常に高いレベルをもたらすが、これらは使用するのが複雑であることができるされている。
本手法は、細菌、酵母およびバイオリアクター系における発現への簡単アクセス可能な代替手段です。表現方法は、高速であり、ローラーボトルまたはフラスコの雰囲気は、5％CO 2で置換されている、標準的な振とうインキュベータが使用される場合は特に、高価な機器の使用を必要としない。私たちは、複数のプラスミドトランスフェを共同文化の> 1 mg / Lの収率で最大5つのタンパク質と複合体を精製するために、これらのプロトコルを使用している。興味深いことに、システムは安定行儀複合体の識別を支援します。たとえば、元HDAC1とSin3Aの二元複合体のpressionは、タンパク質の制限された収量を与え、まだSDS3の追加は、5倍高い量をもたらし、したがって、結晶化に適した構築物および安定な複合体の選択における構造生物学者を案内する。
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、この仕事とレスターコアテクノロジー·サービス大学のために使用される発現構築物を調製するための博士孝文ヤン（PROTEXクローニングサービス）を感謝したいと思います。この作品は、BBSRCの学生の身分によってサポートされていました、ウェルカムトラストプログラムとシニア調査官補助金WT085408＆WT100237とBBSRCはRM31G0224を付与します。
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| FreeStyle HEK 293F cells | LifeTechnologies | R790-07 | |
| FreeStyle 293 Expression Medium | LifeTechnologies | 12338-018 | |
| Anti-FLAG M2 Affinity Gel | SIGMA | A220 | |
| 250 ml Erlenmeyer Flask with Vented Cap | Corning | 431144 | |
| Roller bottles with vented caps | Corning | 01836-02 | |
| Polyethylinamine, 25 kDa, branched | Sigma-Aldrich | 408727 | Make 0.5 mg/ml stocks in H2O, adjust pH to 7.0 with dilute HCl and store at -20 – 4ºC |
| Mammalian expression vector | – | – | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| 0.22 µm Centrifugal Filter Units | Amicon | UFC30GV00 | |
| 15 ml Ultra centrifugal filters (10 kDa cut-off) | Amicon | UFC901008 | |
| Superdex 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 17-5175-01 |
References
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