Выделение Мышиный клапана эндотелиальных клеток
Summary
The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.
Abstract
Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.
Introduction
Зрелый клапан состоит из трех слоев слоистых специализированной внеклеточного матрикса (ECM) перемежаются с клапаном интерстициальных клеток (ИКС) и инкапсулируются одного слоя клапанов сердца эндотелиальных клеток (ЗВТ) 1. Роль ECM является предоставление всех необходимых биомеханические свойства выдерживать постоянные изменения в гемодинамической силы во время сердечного цикла. Оборот клапана ЕСМ во взрослом клапана жестко регулируется ИКС которые в значительной степени в состоянии покоя, и фибробластов, как в отсутствие болезни. В дополнение к популяции VIC, клапанов сердца эндотелиальные клетки (ЗВТ) образуют непрерывную эндотелий по поверхности створок клапана 2. Хотя важность ECM и ВИНК для структуры клапана и функции были описаны нами и другими, роль ЗВТ менее известен. Однако, это сравнительно небольшое популяция клеток является критическим для формирования клапана в зародыше, и описывается как дисфункциональное в клапанеболезнь.
Формирование клапана сердца у эмбриона начинается тогда, когда подмножество эндотелиальных клеток в течение атриовентрикулярного канала и тракта оттока регионах пройти эндотелия к трансформации мезенхимальных (EMT) и форм опухолей, известных как эндокардиальных подушек 1,3. Вновь трансформированные мезенхимальные клетки в этих структурах позже дифференцироваться в ВИНК и образуют зрелые клапаны. После того, как ЕМТ является полным, эндотелиальные клетки, окружающие подушки, называют ЗВТ, образуют непрерывный слой эндотелиальных клеток, который защищает зрелую клапан от травм. Кроме того, ЗВТ ощутить среды гемодинамические и было показано, что молекулярно связи с базовых ИКС регулировать ЕСМ гомеостаза 1,3. В пораженных клапанов, VEC монослой нарушается в связи с аномальными изменениями в ECM организации и измененных биомеханики 4,5. Кроме того, исследования, проведенные в мышиных моделях показывают, что VEC дисфункция является основной причиной клапана Disease 1,6-9. Как ЗВТ играют важную роль в развитии клапана, технического обслуживания и болезни, важно, что мы полностью определить их временные фенотипы в целях продвижения поле и понять механизмы болезни.
Предыдущая работа нескольких лабораториях успешно изолированы ЗВТ из свиных и бараньих моделей 10-12. В связи с большим размером этих клапанов, выделений через подсос и / или ферментативным расщеплением с последующей ряда различных методов изоляции в том числе разделение магнитной шарик клеток и клональной экспансии одной ячейки был эффективен для генерации чистых популяций 11-13. Тем не менее, эти модели могут быть ограничительным в связи с неполной аннотации из свиней и овец геномов, ограничивающих доступность молекулярных инструментов в дополнение к высокой стоимости. Поэтому эксперименты из свинины и баранины ЗВТ после выделения может быть ограничительным. Мышиные модели предпочтительнее в связи с многочисленными возможностями для генетического манипулойния и молекулярные инструменты в зародыше и взрослого, но на сегодняшний день, не было зарегистрировано ни одного VEC изоляция в небольших животных моделях. Вероятно, это связано с трудностью работы с маленькие образцы ткани, которые включают население меньшинства клеток, что в настоящее время не хватает однозначная идентификация VEC-специфических маркеров, тем самым предотвращая основе антител методы изоляции.
В этой статье мы приводим новый метод прямого выделения мышиных ЗВТ в эмбриональных и взрослых этапах. Этот протокол использует Tie-2-GFP мышей, которые экспрессируют GFP во всех типах клеток эндотелия и широко используемых для изучения эндотелиальных клеток популяции 14. Тем не менее, новинка этого текущем исследовании является то, что эти мыши, впервые были использованы для выделения эндотелиальных клеток из клапанов. Путем тщательного рассечения ткани клапана и серии из девяти ферментных пищеварения с последующей FACS сортировки, ЗВТ, могут быть выделены и использованы для различных экспериментальных методов вчисле добычу и культуры РНК, непосредственно после сортировки.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы описываем впервые, новый способ для выделения эмбриональных и взрослых мышей ЗВТ мышей Tie-2-GFP. В то время как эта мышь линия широко используется для выделения эндотелиальных клеточных популяций, это первый отчет, показывающий селективного выделения ЗВТ. В связи с хрупкостью населения VEC, мы разработали строгие протокол, который позволяет для выделения одной ячейки GFP положительной (и GFP отрицательным) клеток из сердечных клапанов эмбриональных и взрослых мышей. По сравнению с первоначальной публикации, используя целые эмбрионы или органов от Tie-2-GFP мышей 14, мы оптимизировали коллагеназа и рассечение шаги, основанные на низкой численности этой хрупкой эндотелиальной клеточной популяции, чтобы изолировать выбора популяцию клеток.
VEC изоляция ранее сообщалось только в больших моделях животных с ограниченными генетических и молекулярно-биологических средств. Эти инструменты хорошо известны у мышей и, следовательно, в ABILITY изолировать мышиных ЗВТ позволяет расширенным набором экспериментальных конструкций, которые будут использоваться для исследований клапана сердца. Таким образом, существенным преимуществом этого подхода является то, что ЗВТ может быть выделен во времени от мышей дикого типа и модели болезни клапана и травмы. Второе преимущество состоит в том, что ЗВТ, могут быть выделены и проанализированы практически сразу после вскрытия, сохраняя характер экспрессии, которые отражают ситуацию в естественных условиях более точно. Кроме того, этот протокол изоляция достаточно для устранения клеточной культуры для расширения числа и поэтому потенциальные изменения фенотипических, вызванных окружающей средой в пробирке предотвращаются.
Несмотря новинок и экспериментальных преимуществ этого протокола, мы признаем, что ограничения все еще существуют. Во-первых, численность населения VEC в мышиных клапанов очень мала и поэтому, несколько приурочен эмбриональные пометы необходимы для того, чтобы генерировать достаточное РНК для анализа экспрессии генов. Хотя Тхис могут быть преодолены с помощью нескольких заводчиков, это может оказать влияние на применении некоторых инструментов анализа пост-изоляции. Это ограничение было непросто, особенно для установления конфлюэнтных культур GFP-положительных ЗВТ для выполнения более тщательного анализа VEC фенотипов в том числе молекулярных профилей и функциональных анализов. Поэтому мы признаем, что не все трудности были преодолены с помощью нашего подхода, но это является сферой интересов, что мы стремимся преодолеть.
Этот подход выделения ЗВТ с клапанными регионов вводит возможность загрязнения от Тай-GFP-положительных, не-клапанных эндотелиальных клеток эндокарда, или сосудистых структур в миокарда желудочков. На сегодняшний день, молекулярная отличие ЗВТ от других популяций сердечных эндотелиальных клеток не выявлено. Тем не менее энхансера гена Nfatc1 была определена и показана в частности, маркировать ЗВТ, которые непройти EMT, и никакой другой эндотелиальных клеток население в сердце 18. Как Cre модель (Nfatc1 Encre) доступен, будущие исследования могли бы использовать специфику этой линии, чтобы минимизировать риски загрязнения. В дополнение к не-клапанных Tie2-GFP- положительных клеток, всегда есть возможность загрязнения от миоцитов в точке, где листовки клапанов прикрепляются к кольцевой области септальной и росписи миокарда стен. В данных не показаны здесь, мы изначально начали исследования, чтобы изолировать ЗВТ от расчлененных клапанных регионов с использованием антител, конъюгированных шарики, покрытые анти-GFP и анти-CD31. Хотя этот подход был успешным для выделения эндотелиальных клеток, мы испытали значительное слипания клеток из соседних, не-эндотелиальных типов клеток и, следовательно, ВИНК и клетки миокарда загрязненных наш опытный образец. Это было избежать с помощью анализа FACS, как параметры были установлены, чтобы изолировать только суспензии отдельных клетокс и ПЦР-анализ для обнаружения выражение миоцитов-специфических генов контролирует этого ограничения (рисунок 3). В то время как наша загрязнение может считаться как минимальные, это остается потенциальным экспериментальная сложность которых можно было бы избежать в будущем с двойным выбором GFP и эндотелиальных маркеров поверхностных клеточных конкретных.
Используя этот протокол, мы успешно изолированных ЗВТ из эмбриональных и взрослых мышей и приведены примеры того, как этот подход может быть использован для выделения РНК и культуре клеток GFP позитивных и GFP популяций клеток отрицательно. Тем не менее, этот подход не ограничивается этими приложений и может быть использован для множества молекулярных, клеточных и функциональных подходов. Кроме того, Tie2-GFP фон может быть выведена с генетическими мышиных моделях, что позволит сравнительных исследований VEC населения в норме и патологии. Развитие этого нового методологии будет, впервые, позволяют сфокусированных исследованийизучение вклада ЗВТ в развитии клапана и обслуживания и может выявить ранее неоцененные механизмы эндотелиальной-зависимых заболеваний клапана.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Университет штата Огайо Центр Комплексная Рак Аналитический Cytometry основной комплекс, а именно Катрина Мур, для оказания технической помощи с анализа FACS. Кроме того, мы признаем, доктора Уильяма Pu и его группу за их научных знаний. Эта работа была поддержана NIH HL091878 (JL) и сердечного центра в Национальной детской больницы.
Materials
| [header] | |||
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rat IgG (H+L) | Life Technologies | A-11077 | |
| 70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| 2.5% Trypsin | Invitrogen LT | 15090-046 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, Heat Shock Treated | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| CD31 rat anti-mouse antibody | BD Pharmingen | 553370 | |
| Chick Serum | Invitrogen LT | 16110-082 | |
| Collagenase IV | Invitrogen LT | 17104-019 | Prepared according to manufactuer's instructions |
| DNase I, RNase free (10,000 Units) | Roche | 4716728001 | |
| EBM-2 | Lonza | CC3156 | For VEC media |
| EDTA, 0.5M Solution | Hoefer | 03-500-506 | |
| EGM2 SingleQuot, Bulletkit | Lonza | CC-4176 | For VEC media |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Hyclone | SH3007103IH | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 14025-092 | |
| Horse Serum | Invitrogen LT | 16050-130 | |
| Hybridization Oven | VWR | 230301V | |
| Medium 199 1X | Corning Cell gro | 10-060-CV | |
| Paraformaldehyde 16% Solution EM grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Pen/Strep | MP-Biomed | ICN1670049 | |
| Permanox sterile chamber slide with cover | Thermo-Scientific | 177429 | |
| Phosphate-Buffered Saline, 1X | Corning Cell gro | 21-040-CV | |
| PrimeTime Mini qPCR Assay | Integrated DNA Technologies | Acta2 (αSMA), GAPDH, Myh6, Myh7, POSTN, CD31, vWF | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4376600 | |
| SuperScript VILO Mastermix | Invitrogen LT | 11755050 | |
| Tie2-GFP mice | Jackson Laboratories | 3658 | |
| Tissue forceps #5 11cm | Dumont | 14096 | |
| Trizol | Ambion | 15596018 | |
| α-SMA anti-mouse antibody | Sigma-Aldrich | A2547 | |
| VECTASHIELD HardSet Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 |
References
- Tao, G., Kotick, J. D., Lincoln, J. Heart valve development, maintenance, and disease: the role of endothelial cells. Current topics in developmental biology. 100, 203-232 (2012).
- Lincoln, J., Yutzey, K. E. Molecular and developmental mechanisms of congenital heart valve disease. Birth defects research. Part A, Clinical and molecular teratology. 91, 526-534 (2011).
- Tao, G., Levay, A. K., Gridley, T., Lincoln, J. Mmp15 is a direct target of Snai1 during endothelial to mesenchymal transformation and endocardial cushion development. Developmental biology. 359, 209-221 (2011).
- Weinberg, E. J., Mack, P. J., Schoen, F. J., Garcia-Cardena, G., Kaazempur Mofrad, M. R. Hemodynamic environments from opposing sides of human aortic valve leaflets evoke distinct endothelial phenotypes in vitro. Cardiovasc Eng. 10, 5-11 (2010).
- Hinton, R. B. Extracellular matrix remodeling and organization in developing and diseased aortic valves. Circulation research. 98, 1431-1438 (2006).
- Gould, S. T., Srigunapalan, S., Simmons, C. A., Anseth, K. S. Hemodynamic and cellular response feedback in calcific aortic valve disease. Circulation research. 113, 186-197 (2013).
- Bosse, K., et al. Endothelial nitric oxide signaling regulates Notch1 in aortic valve disease. Journal of molecular and cellular cardiology. 60, 27-35 (2013).
- Laforest, B., Andelfinger, G., Nemer, M. Loss of Gata5 in mice leads to bicuspid aortic valve. The Journal of clinical investigation. 121, 2876-2887 (2011).
- Hofmann, J. J., et al. Endothelial deletion of murine Jag1 leads to valve calcification and congenital heart defects associated with Alagille syndrome. Development. 139, 4449-4460 (2012).
- Wylie-Sears, J., Aikawa, E., Levine, R. A., Yang, J. H., Bischoff, J. Mitral valve endothelial cells with osteogenic differentiation potential. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 31, 598-607 (2011).
- Gould, R. A., Butcher, J. T. Isolation of valvular endothelial cells. Journal of Visualized Experiments : JoVE. , (2010).
- Butcher, J. T., Penrod, A. M., Garcia, A. J., Nerem, R. M. Unique morphology and focal adhesion development of valvular endothelial cells in static and fluid flow environments. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 24, 1429-1434 (2004).
- Cheung, W. Y., Young, E. W., Simmons, C. A. Techniques for isolating and purifying porcine aortic valve endothelial cells. The Journal of heart valve disease. 17, 674-681 (2008).
- Motoike, T., et al. Universal GFP reporter for the study of vascular development. Genesis. 28, 75-81 (2000).
- Peacock, J. D., Lu, Y., Koch, M., Kadler, K. E., Lincoln, J. Temporal and spatial expression of collagens during murine atrioventricular heart valve development and maintenance. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 237, 3051-3058 (2008).
- Levay, A. K., et al. Scleraxis is required for cell lineage differentiation and extracellular matrix remodeling during murine heart valve formation in vivo. Circulation research. 103, 948-956 (2008).
- Lincoln, J., Alfieri, C. M., Yutzey, K. E. BMP and FGF regulatory pathways control cell lineage diversification of heart valve precursor cells. Developmental biology. 292, 292-302 (2006).
- Wu, B., et al. Nfatc1 coordinates valve endocardial cell lineage development required for heart valve formation. Circulation research. 109, 183-192 (2011).
