Murin Vana Endotel Hücreleri İzolasyon
Summary
The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.
Abstract
Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.
Introduction
Olgun kapak vana endotel hücrelerinin (VECs) 1, tek bir tabaka ile özel bir hücre dışı bir valf interstitial hücrelerin (kurban) serpiştirilmiş matriks (ECM) ile kapsüllenmiş üç katmanlı tabakadan oluşur. ECM rolü kalp döngüsü boyunca hemodinamik yürürlükteki sürekli değişir dayanmak için bütün gerekli biyomekanik özellikleri temin etmektir. Yetişkin vana supap ECM'nin devir sıkıca büyük ölçüde hareketsiz ve hastalık yokluğunda fibroblast gibi kurban düzenlenir. VIC nüfus ek olarak, kalp kapakçığı endotel hücreleri (VECs) vana çizgilerinin 2'nin yüzeyi üzerinde kesintisiz bir endotelyumu oluşturur. Kapak yapısı ve fonksiyonu için ECM ve kurban önemi bizim ve başkaları tarafından tarif edilmiş olmasına rağmen, VECs rolü daha az iyi bilinmektedir. Ancak bu nispeten küçük hücre popülasyonu embriyo kapak oluşumu için çok önemli olan ve valf içindeki işlevsel olarak tanımlanmaktadırhastalığı.
Atriyoventriküler kanal ve çıkış yolu bölgeler içinde endotel hücrelerinin bir alt mezenkimal dönüşüm (EMT) ve endokardial minderler 1,3 şekli olarak bilinen şişlikler için endotelyal uğradıklannda embriyo kalp kapak oluşumu başlar. Bu yapıların içindeki yeni dönüştürülmüş mezenkimal hücreler, daha sonra kurbanlardan farklılaşmak ve olgun vanaları oluştururlar. EMT tamamlandıktan sonra, yastıklar çevreleyen endotel hücreleri, VECs olarak adlandırılan yaralanmalara karşı koruma valfını olgun kesintisiz bir endotel hücre tabakasını oluşturur. Buna ek olarak, VECs hemodinamik çevre anlamda ECM 1,3 homeostazı düzenlemek için altta yatan kurban ile iletişim kurmak için, moleküler gösterilmiştir. Hasta kapaklarda, VEC tek tabaka ECM organizasyon anormal değişiklikler ve değişmiş biyomekanikteki 4,5 ile birlikte bozulur. Buna ek olarak, fare modelinde yapılan çalışmalar, VEC disfonksiyon kapak d altta yatan nedeni olduğunu göstermektedirhastalığı bulunanlarda 1,6-9. VECs vana geliştirme, bakım, hastalık ve önemli bir rol oynadığı gibi, biz tamamen alanını ilerletmek ve hastalık mekanizmalarını anlamak için kendi zamansal fenotipleri tanımlamak önemlidir.
Birkaç laboratuarları önceki çalışması başarıyla domuz ve koyun modelleri 10-12 VECs izole edilmiştir. Bu sebeplerden dolayı valf büyük boyutları nedeniyle, manyetik tane hücre ayrıştırma ve tek bir hücre klonal olarak saf popülasyonları 11-13 oluşturmak için etkili olmuştur izolasyon dahil olmak üzere farklı bir dizi yöntem ile, ardından, sürme ve / veya enzimatik sindirim yoluyla sağlayan tecritler uygulanmıştır. Ancak, bu modeller sayesinde yüksek maliyetlerine ek olarak moleküler araçlarının kullanılabilirliğini sınırlayan domuz ve koyun genomların eksik açıklama için kısıtlayıcı olabilir. Bu nedenle izolasyon sonra domuz ve küçükbaş VECs bir deney kısıtlayıcı olabilir. Fare modelleri nedeniyle genetik manipü için birçok olasılığa tercih ediliryon embriyonun ve yetişkin moleküler araçları, ancak bugüne kadar küçük hayvan modellerinde herhangi bir izolasyon VEC bildirilmiştir. Bu durum şu anda böylece antikor bazlı izolasyon yöntemleri önlenmesi, VEC-spesifik belirteçler benzersiz kimliğini yoksun bir azınlık hücre popülasyonu içeren küçük doku örnekleri ile çalışma zorluk muhtemeldir.
Bu makalede, embriyonik ve yetişkin aşamalarında sıçangil VECs direkt izolasyonu için yeni bir yöntem sunulmaktadır. Bu protokol, her endotel hücre tiplerinde ekspres GFP ve kapsamlı bir endotel hücre popülasyonlarının 14 incelemek için kullanılmıştır Tie2-GFP farelerden, yararlanır. Bununla birlikte, bu çalışmada bir yenilik, ilk kez bu fareler, vanalardan endotel hücreleri izole etmek için kullanılmıştır olmasıdır. Kapak dokusu ve FACS ayıklama, ardından dokuz enzimatik sindirim, bir dizi dikkatli diseksiyon ile, VECs izole edilebilir ve çeşitli deneysel teknikler kullanılmaktadırdoğrudan sıralama aşağıdaki RNA ekstraksiyon ve kültürünü tutabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada ilk kez tarif Tie2-GFP farelerden elde edilen murin embriyonik ve yetişkin VECs izolasyonu için yeni bir yöntem. Bu fare hattı yaygın endotel hücre popülasyonlarının izolasyonu için kullanılmış olsa da, bu VECs seçici izolasyonu gösteren ilk rapordur. Nedeniyle VEC nüfusun kırılganlığı, embriyonik ve yetişkin farelerin kalp kapakçıkları olumlu GFP (ve GFP negatif) hücrelerin tek hücre izolasyonu sağlayan bir sıkı protokol geliştirdik. Tie2-GFP farelerden alınan bütün 14 embriyolar ya da organları kullanarak orijinal yayın karşılaştırıldığında, hücrelerin seçilmiş bir popülasyonu izole etmek üzere, bu kırılgan endotel hücre popülasyonunun düşük yoğunlukta göre kolajenaz ve kesilmesi adımlarını optimize ettik.
VEC izolasyon önce sadece sınırlı bir genetik ve biyomoleküler araçları ile büyük hayvan modellerinde bildirilmiştir. Bu araçlar iyi, bu nedenle abi farelerde kurulmuş ve kendilerinesıçangil VECs izole edilmesi için vasıflı kapak araştırma için kullanılacak deney tasarımları genişletilmiş bir dizi sağlar. Bu nedenle, bu yaklaşımın önemli bir avantajı, VECs Vahşi tip farelerde ve kapak hastalığı ve yaralanma modellerinin geçici olarak izole edilebilir olmasıdır. İkinci bir avantaj VECs izole edilmiş ve daha kesin bir şekilde, in vivo durumu yansıtan ekspresyonu koruyarak, diseksiyon hemen sonra analiz edilebilmesidir. Bundan başka, bu yalıtım protokol numarası genişlemesi ve in vitro ortamda neden olduğu, bu nedenle potansiyel fenotipik değişikliklerin engellenmesi hücre kültürü ortadan kaldırmak için yeterlidir.
Yenilikleri ve bu protokol deneysel yararlarına rağmen, biz sınırlamalar hala varolduğunu. İlk olarak, kemirgen vanalarındaki VEC nüfusun boyutu çok küçük ve bu nedenle birden fazla zamana embriyonik yavrular gen ekspresyon analizi için yeterli RNA'yı üretmek için gerekli olmasıdır. Thi ikens Birden yetiştiricilerin kullanılarak aşılabilir, bazı post-izolasyon analiz araçları uygulama üzerinde bir etkisi olabilir. Bu sınırlama özellikle moleküler profil ve fonksiyonel analizleri dahil olmak VECT fenotipleri daha kapsamlı analizler gerçekleştirmek için GFP pozitif VECs kaynaşmaya kültürleri kurulması için bir meydan okuma olmuştur. Bu nedenle biz değil tüm zorluklar bizim yaklaşımla üstesinden edildiğini kabul ama bu üstesinden gelmek için çalışıyoruz ilgi alanıdır.
Kapak bölgelerden VECs izole Bu yaklaşım ventriküler miyokard içinde endokarda, veya vasküler yapıların Tie-GFP -pozitif, non-valvüler endotel hücrelerinden kirlenme olasılığını tanıttı. Bugüne kadar, diğer kalp endotel hücre popülasyonlarından VECs moleküler fark tespit edilmemiştir. Ancak Nfatc1 geninin bir artırıcı bölge tanımlanmış ve spesifik olarak yok olduğunu VECs etiket gösterilmiştirkalp 18 içinde EMT ve başka bir endotel hücre popülasyonu tabi tutulur. Cre modeli (Nfatc1 encre) olarak mevcuttur, gelecekteki çalışmalar kontaminasyon riskleri en aza indirmek için bu hattın özgüllüğünü faydalanabilirler. Non-valvüler Tie2-GFP- pozitif hücrelerinin yanı sıra, kapakçıkların septal ve duvar miyokard duvarların dairesel bölgeye eklemek noktada miyositlerden kirlenme olasılığı her zaman vardır. Burada veriler gösterilmemiştir, başlangıçta, anti-GFP ve anti-CD31 antikoru ile kaplanmış konjuge edilmiş boncuklar kullanılarak kesilmiş kapak bölgelerden VECs izole etmek için çalışmalar başladı. Bu yaklaşım, endotel hücreleri izole etmek için başarılı iken, biz bitişik olmayan endotel hücre tiplerinden önemli hücre topaklanma deneyimli ve bu nedenle kurbanda ve miyokard hücreleri bizim deneysel örnek kirlenmiş. Bu parametreler sadece tek hücre süspansiyonu yalıtmak için ayarlanmış gibi FACS analizi kullanılarak kaçınılması olmuşturS ve PCR analizi, miyosit spesifik genlerin ekspresyonu, bu sınırlama (Şekil 3) için kontrol edilen şekilde tespit etmek. Bizim kontaminasyon minimum olarak kabul edilebilir olsa da, GFP ve endotel hücre-spesifik yüzey belirteçlerinin çift seçimi ile gelecekte önlenebilir potansiyel bir deneysel karmaşıklık kalır.
Bu protokolü kullanarak, embriyonik ve yetişkin fareler ve bu yaklaşım RNA izolasyonu ve GFP ve GFP pozitif negatif hücre popülasyonlarının, hücre kültürü için kullanılabilir olduğuna ilişkin örneklerden başarılı bir şekilde izole VECs sahiptir. Bununla birlikte bu yaklaşım, bu uygulamalarla sınırlı değildir, ve hücresel ve moleküler fonksiyonel yaklaşımları bir bolluk için kullanılabilir. Ayrıca, Tie2-GFP arka plan, hastalık ve sağlıkta VECT nüfus karşılaştırmalı çalışmalar için izin verecektir genetik fare modelleri ile yetiştirilen olabilir. Bu yeni yöntemin geliştirilmesi, ilk kez, odaklanmış çalışmaları için sağlayacaktırvana geliştirme ve bakım VECs katkısını inceleyen ve endotel-bağımlı kapak hastalığı önceden hesaba katılmayan mekanizmalarını ortaya koyabilir.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz FACs analizi ile teknik yardım için Ohio State Üniversitesi Kapsamlı Kanser Merkezi Analitik Cytometry Çekirdek tesisi, özellikle Katrina Moore, teşekkür ederim. Ayrıca biz onların bilimsel anlayışlar için Dr William Pu ve onun grubunu tanır. Bu çalışma NIH HL091878 (JL) ve Nationwide Çocuk Hastanesi Kalp Merkezi tarafından desteklenmiştir.
Materials
| [header] | |||
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rat IgG (H+L) | Life Technologies | A-11077 | |
| 70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| 2.5% Trypsin | Invitrogen LT | 15090-046 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, Heat Shock Treated | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| CD31 rat anti-mouse antibody | BD Pharmingen | 553370 | |
| Chick Serum | Invitrogen LT | 16110-082 | |
| Collagenase IV | Invitrogen LT | 17104-019 | Prepared according to manufactuer's instructions |
| DNase I, RNase free (10,000 Units) | Roche | 4716728001 | |
| EBM-2 | Lonza | CC3156 | For VEC media |
| EDTA, 0.5M Solution | Hoefer | 03-500-506 | |
| EGM2 SingleQuot, Bulletkit | Lonza | CC-4176 | For VEC media |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Hyclone | SH3007103IH | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 14025-092 | |
| Horse Serum | Invitrogen LT | 16050-130 | |
| Hybridization Oven | VWR | 230301V | |
| Medium 199 1X | Corning Cell gro | 10-060-CV | |
| Paraformaldehyde 16% Solution EM grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Pen/Strep | MP-Biomed | ICN1670049 | |
| Permanox sterile chamber slide with cover | Thermo-Scientific | 177429 | |
| Phosphate-Buffered Saline, 1X | Corning Cell gro | 21-040-CV | |
| PrimeTime Mini qPCR Assay | Integrated DNA Technologies | Acta2 (αSMA), GAPDH, Myh6, Myh7, POSTN, CD31, vWF | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4376600 | |
| SuperScript VILO Mastermix | Invitrogen LT | 11755050 | |
| Tie2-GFP mice | Jackson Laboratories | 3658 | |
| Tissue forceps #5 11cm | Dumont | 14096 | |
| Trizol | Ambion | 15596018 | |
| α-SMA anti-mouse antibody | Sigma-Aldrich | A2547 | |
| VECTASHIELD HardSet Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 |
References
- Tao, G., Kotick, J. D., Lincoln, J. Heart valve development, maintenance, and disease: the role of endothelial cells. Current topics in developmental biology. 100, 203-232 (2012).
- Lincoln, J., Yutzey, K. E. Molecular and developmental mechanisms of congenital heart valve disease. Birth defects research. Part A, Clinical and molecular teratology. 91, 526-534 (2011).
- Tao, G., Levay, A. K., Gridley, T., Lincoln, J. Mmp15 is a direct target of Snai1 during endothelial to mesenchymal transformation and endocardial cushion development. Developmental biology. 359, 209-221 (2011).
- Weinberg, E. J., Mack, P. J., Schoen, F. J., Garcia-Cardena, G., Kaazempur Mofrad, M. R. Hemodynamic environments from opposing sides of human aortic valve leaflets evoke distinct endothelial phenotypes in vitro. Cardiovasc Eng. 10, 5-11 (2010).
- Hinton, R. B. Extracellular matrix remodeling and organization in developing and diseased aortic valves. Circulation research. 98, 1431-1438 (2006).
- Gould, S. T., Srigunapalan, S., Simmons, C. A., Anseth, K. S. Hemodynamic and cellular response feedback in calcific aortic valve disease. Circulation research. 113, 186-197 (2013).
- Bosse, K., et al. Endothelial nitric oxide signaling regulates Notch1 in aortic valve disease. Journal of molecular and cellular cardiology. 60, 27-35 (2013).
- Laforest, B., Andelfinger, G., Nemer, M. Loss of Gata5 in mice leads to bicuspid aortic valve. The Journal of clinical investigation. 121, 2876-2887 (2011).
- Hofmann, J. J., et al. Endothelial deletion of murine Jag1 leads to valve calcification and congenital heart defects associated with Alagille syndrome. Development. 139, 4449-4460 (2012).
- Wylie-Sears, J., Aikawa, E., Levine, R. A., Yang, J. H., Bischoff, J. Mitral valve endothelial cells with osteogenic differentiation potential. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 31, 598-607 (2011).
- Gould, R. A., Butcher, J. T. Isolation of valvular endothelial cells. Journal of Visualized Experiments : JoVE. , (2010).
- Butcher, J. T., Penrod, A. M., Garcia, A. J., Nerem, R. M. Unique morphology and focal adhesion development of valvular endothelial cells in static and fluid flow environments. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 24, 1429-1434 (2004).
- Cheung, W. Y., Young, E. W., Simmons, C. A. Techniques for isolating and purifying porcine aortic valve endothelial cells. The Journal of heart valve disease. 17, 674-681 (2008).
- Motoike, T., et al. Universal GFP reporter for the study of vascular development. Genesis. 28, 75-81 (2000).
- Peacock, J. D., Lu, Y., Koch, M., Kadler, K. E., Lincoln, J. Temporal and spatial expression of collagens during murine atrioventricular heart valve development and maintenance. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 237, 3051-3058 (2008).
- Levay, A. K., et al. Scleraxis is required for cell lineage differentiation and extracellular matrix remodeling during murine heart valve formation in vivo. Circulation research. 103, 948-956 (2008).
- Lincoln, J., Alfieri, C. M., Yutzey, K. E. BMP and FGF regulatory pathways control cell lineage diversification of heart valve precursor cells. Developmental biology. 292, 292-302 (2006).
- Wu, B., et al. Nfatc1 coordinates valve endocardial cell lineage development required for heart valve formation. Circulation research. 109, 183-192 (2011).
