בידוד של תאי Murine Valve האנדותל
Summary
The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.
Abstract
Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.
Introduction
השסתום הבוגר מורכב משלוש שכבות מרובד של מטריצה מיוחדת תאית (ECM) וביניהם תאי ביניים שסתום (Vics) ומארז ידי שכבה אחת של תאי שסתום לב האנדותל (VECs) 1. התפקיד של ECM הוא לספק את כל המאפיינים ביומכנית הצורך להתמודד עם שינויים מתמידים בכוח המודינמית במהלך מחזור הלב. מחזור מסחר של ECM השסתום בשסתום המבוגר מוסדר בחוזקה על ידי Vics שהם במידה רבה שקטים ודמויים פיברובלסטים בהעדר המחלה. בנוסף לאוכלוסיית VIC, תאי שסתום לב האנדותל (VECs) יוצרים האנדותל ללא הפרעה על פני השטח של cusps השסתום 2. למרות החשיבות של ECM וVics למבנה שסתום ותפקוד תוארה על ידינו ואחרים, התפקיד של VECs ידוע פחות. עם זאת, אוכלוסיית תאים קטנה יחסית זו היא קריטית להיווצרות שסתום בעובר, והוא מתואר כמתפקד בשסתוםמחלה.
היווצרות שסתום לב בעובר מתחילה כאשר תת קבוצה של תאי האנדותל באזורי תעלה ודרכי יצוא בין העליות וחדרים לעבור אנדותל לשינוי mesenchymal (EMT) ונפיחויות טופס הידוע כ כריות endocardial 1,3. תאי מזנכימה הפכו עתה בתוך מבנים אלו מאוחר יותר להתמיין Vics ויוצרים את השסתומים הבוגרים. ברגע שEMT הוא מלא, תאי האנדותל המקיפים את הכריות, כינו VECs, יוצרים שכבת תאי האנדותל רציפה המגנה על הסתום הבוגר מפני פגיעה. בנוסף, VECs לחוש את הסביבה המודינמית והוכח מולקולריים לתקשר עם Vics הבסיסי להסדיר ECM הומאוסטזיס 1,3. בשסתומים חולים, monolayer VEC מופר בשיתוף עם שינויים חריגים בארגון ECM וביומכניקה שינתה 4,5. בנוסף, מחקרים במודלים של עכברים מראים כי בעיות בתפקוד VEC היא הסיבה הבסיסית של ד השסתוםisease 1,6-9. כVECs לשחק תפקיד חשוב בהתפתחות שסתום, תחזוקה, ומחלה, חשוב שאנו מגדירים באופן מלא פנוטיפים זמניים שלהם על מנת לקדם את התחום ולהבין את המנגנונים של מחלה.
העבודה קודמת על ידי מספר מעבדות הצליחה לבודד בהצלחה VECs מדגמים חזירי וכבש 10-12. בשל גודלו הגדול של שסתומים האלה, בידודים דרך ו / או עיכול אנזימטי בניקוי, ואחריו במספר שיטות בידוד השונים כולל הפרדה מגנטית של תאי חרוז והרחבה משובט תא הבודד היה יעיל ליצור אוכלוסיות טהורות 11-13. עם זאת, מודלים אלו יכולים להיות מגבילים בשל הביאור שלם של הגנום החזיר וכבשים המגביל את הזמינות של כלים מולקולריים, בנוסף לעלויות גבוהות. לכן ניסויים של חזירי וVECs כבש לאחר הבידוד יכולים להיות מגבילים. מודלים עכבר עדיפים בשל אפשרויות רבות לmanipula הגנטיtion וכלים מולקולריים בעובר והמבוגר, אך עד היום, לא בידודי VEC במודלים של בעלי חיים קטנים כבר דיווחו. זה כנראה עקב הקושי של עבודה עם דגימות רקמה קטנות הכוללות אוכלוסיית תאי מיעוט שכיום אין זהות ייחודית של סמני VEC ספציפיים, ובכך למנוע שיטות בידוד מבוסס נוגדנים.
במאמר זה, אנו מדווחים על שיטה חדשה לבידוד ישיר של VECs העכברי בשלבים עובריים ובוגרים. פרוטוקול זה מנצל עכברי Tie2-GFP, אשר מבטאים GFP בכל סוגי אנדותל התא ונעשה שימוש נרחב ללמוד אוכלוסיות תאי אנדותל 14. עם זאת, החידוש של המחקר הנוכחי הוא שעכברים אלה, בפעם הראשונה כבר נוצלו לבודד תאי אנדותל מהשסתומים. על ידי נתיחה מדוקדקת של רקמת השסתום וסדרה של תשעה digestions האנזימטית ואחרי מיון FACS, יכול להיות מבודד VECs ומשמש לניסיוני בטכניקות שונות בcluding מיצוי RNA ותרבות, ישירות הבא מיון.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן אנו מתארים בפעם הראשונה, שיטה חדשנית לבידודה של VECs העכברי העוברי ובוגרת מעכברי Tie2-GFP. בעוד קו עכבר זה נעשה שימוש נרחב לבידוד של אוכלוסיות תאי אנדותל, זה הדו"ח הראשון, המראה בידוד סלקטיבי של VECs. בשל שבריריותה של אוכלוסיית VEC, פיתחנו פרוטוקול מחמיר המאפשר בידוד תא בודד של GFP החיובי (ושלילי GFP) תאים מסתמי לב של עוברי עכברים ומבוגרים. בהשוואה לפרסום המקורי לשימוש בעוברים או באיברים שלמים מעכברי Tie2-GFP 14, יש לנו מותאם צעדי collagenase ונתיחה מבוססים על השפע הנמוך של אוכלוסיית תאי אנדותל השבירה הזה כדי לבודד אוכלוסייה נבחרת של תאים.
בידודי VEC בעבר כבר דיווחו רק במודלים של בעלי חיים גדולים עם כלים גנטיים וbiomolecular מוגבלים. כלים אלה מבוססים היטב בעכברים, ולכן, ABIlity לבודד VECs העכברי מאפשר לקבוצה מורחבת של עיצובים ניסיוניים שישמשו לשסתום לב מחקר. לכן, יתרון משמעותי של גישה זו הוא כי ניתן לבודד VECs temporally מעכברים פראיים סוג, ומודלים של מחלת שסתום ופציעה. יתרון שני הוא שיכול להיות מבודד VECs ונותח כמעט מייד לאחר נתיחה, שימור דפוסי ביטוי שמשקפים את מצב in vivo בצורה מדויקת יותר. יתר על כן, פרוטוקול הבידוד די בכך כדי לחסל תרבית תאים להרחבת מספר ושינויי פנוטיפי לכן פוטנציאל הנגרמים על ידי הסביבה במבחנה מנועים.
למרות החידושים והטבות ניסיוניות של פרוטוקול זה, אנחנו מכירים בכך שמגבלות עדיין קיימות. ראשית, גודלה של אוכלוסיית VEC בתוך שסתומים עכבריים הוא מאוד קטן, ולכן, יש צורך בהמלטות עוברית מתוזמן מרובים על מנת ליצור RNA מספיק לניתוח ביטוי גנים. בעוד thiים ניתן להתגבר באמצעות מגדלים מרובים, עשוי להיות לכך השפעה על היישום של כמה כלי ניתוח שלאחר בידוד. מגבלה זו כבר אתגר במיוחד להקמת תרבויות ומחוברות של VECs GFP החיובי על מנת לבצע יותר ניתוחים מעמיקים של פנוטיפים VEC כוללים פרופילים מולקולריים ומבחנים פונקציונליים. לכן אנו מכירים בכך שלא כל הקשיים היו להתגבר על ידי הגישה שלנו, אבל זה שטח של עניין שאנו שואפים להתגבר.
גישה זו של בידוד VECs מאזורים מסתמית מציגה את האפשרות של זיהום מתאי העניבה-GFP -positive, שאינם מסתמית האנדותל של endocardium, או מבנים של כלי דם בתוך שריר הלב של החדר. נכון להיום, הבחנה מולקולרית של VECs מאוכלוסיות תאים אחרות לב אנדותל לא זוהתה. עם זאת אזור משפר של גן Nfatc1 זוהה ומוצג לתייג במיוחד VECs שלאעובר EMT, ולא אוכלוסיית תאי אנדותל אחרת בתוך הלב 18. כמודל Cre (Nfatc1 enCre) זמין, מחקרים עתידיים יכולים לנצל את הספציפיות של קו זה כדי להקטין את סיכוני זיהום. בנוסף לתאים חיוביים Tie2-GFP- לא מסתמית, תמיד יש את האפשרות של זיהום מmyocytes בנקודה שבי עלוני השסתום לצרף לאזור טבעתי של המחיצה וקירות שריר לב ציור קיר. במידע לא מוצג כאן, אנחנו בהתחלה החלו את הלימודים כדי לבודד VECs מאזורים מסתמית גזורים באמצעות חרוזים נוגדן מצומדות- מצופים באנטי-GFP ואנטי CD31. בעוד גישה זו הייתה מוצלחת לבידוד תאי האנדותל, שחווינו בצעדים כבדים תא משמעותיים מסוגים סמוכים, שאינו אנדותל תא ולכן Vics ותאי שריר לב מזוהמים מדגם הניסוי שלנו. זה כבר נמנע מלהשתמש בניתוח FACS כפי שנקבעו פרמטרים לבודד את ההשעיה תא בודדת בלבדים וניתוח PCR לזיהוי הביטוי של גני myocyte ספציפי שולט למגבלה זו (איור 3). בעוד הזיהום שלנו יכול להיחשב כמינימאלי, הוא נשאר מורכבות ניסוי פוטנציאליות אשר יכול להימנע בעתיד עם הבחירה הכפולה של GFP וסמנים פני תא ספציפי אנדותל.
שימוש בפרוטוקול זה, יש לנו VECs המבודד בהצלחה מעכברים עובריים ובוגרים ודוגמאות הניתנות לאופן שגישה זו יכולה לשמש לבידוד RNA ותרבית תאים של אוכלוסיות תאים שליליים חיוביות וGFP GFP. עם זאת, גישה זו אינה מוגבלת ליישומים אלו וניתן להשתמש בו לשפע של גישות מולקולריות, תאיות ופונקציונליות. בנוסף, רקע Tie2-GFP ניתן התרבה עם מודלים עכבר גנטיים שיאפשר למחקרים השוואתיים של אוכלוסיות VEC בבריאות ובחוליים. פיתוח מתודולוגיה רומן זה, בפעם הראשונה, לאפשר ללימודים ממוקדיםבחינת התרומה של VECs בפיתוח שסתום ותחזוקה ויכול לחשוף את מנגנונים שלא מעריכים את העבר של מחלת שסתום אנדותל תלוי.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים למתקן אוניברסיטת אוהיו המקיף סרטן מרכז אנליטי Cytometry Core, במיוחד קתרינה מור, לקבלת סיוע טכני עם ניתוח FACS. בנוסף אנו מכירים ד"ר ויליאם פו וקבוצתו לתובנה המדעיות שלהם. עבודה זו נתמכה על ידי NIH HL091878 (JL) ומרכז הלב בבית החולים לילדים בפריסה ארצית.
Materials
| [header] | |||
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rat IgG (H+L) | Life Technologies | A-11077 | |
| 70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| 2.5% Trypsin | Invitrogen LT | 15090-046 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, Heat Shock Treated | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| CD31 rat anti-mouse antibody | BD Pharmingen | 553370 | |
| Chick Serum | Invitrogen LT | 16110-082 | |
| Collagenase IV | Invitrogen LT | 17104-019 | Prepared according to manufactuer's instructions |
| DNase I, RNase free (10,000 Units) | Roche | 4716728001 | |
| EBM-2 | Lonza | CC3156 | For VEC media |
| EDTA, 0.5M Solution | Hoefer | 03-500-506 | |
| EGM2 SingleQuot, Bulletkit | Lonza | CC-4176 | For VEC media |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Hyclone | SH3007103IH | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 14025-092 | |
| Horse Serum | Invitrogen LT | 16050-130 | |
| Hybridization Oven | VWR | 230301V | |
| Medium 199 1X | Corning Cell gro | 10-060-CV | |
| Paraformaldehyde 16% Solution EM grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Pen/Strep | MP-Biomed | ICN1670049 | |
| Permanox sterile chamber slide with cover | Thermo-Scientific | 177429 | |
| Phosphate-Buffered Saline, 1X | Corning Cell gro | 21-040-CV | |
| PrimeTime Mini qPCR Assay | Integrated DNA Technologies | Acta2 (αSMA), GAPDH, Myh6, Myh7, POSTN, CD31, vWF | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4376600 | |
| SuperScript VILO Mastermix | Invitrogen LT | 11755050 | |
| Tie2-GFP mice | Jackson Laboratories | 3658 | |
| Tissue forceps #5 11cm | Dumont | 14096 | |
| Trizol | Ambion | 15596018 | |
| α-SMA anti-mouse antibody | Sigma-Aldrich | A2547 | |
| VECTASHIELD HardSet Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 |
References
- Tao, G., Kotick, J. D., Lincoln, J. Heart valve development, maintenance, and disease: the role of endothelial cells. Current topics in developmental biology. 100, 203-232 (2012).
- Lincoln, J., Yutzey, K. E. Molecular and developmental mechanisms of congenital heart valve disease. Birth defects research. Part A, Clinical and molecular teratology. 91, 526-534 (2011).
- Tao, G., Levay, A. K., Gridley, T., Lincoln, J. Mmp15 is a direct target of Snai1 during endothelial to mesenchymal transformation and endocardial cushion development. Developmental biology. 359, 209-221 (2011).
- Weinberg, E. J., Mack, P. J., Schoen, F. J., Garcia-Cardena, G., Kaazempur Mofrad, M. R. Hemodynamic environments from opposing sides of human aortic valve leaflets evoke distinct endothelial phenotypes in vitro. Cardiovasc Eng. 10, 5-11 (2010).
- Hinton, R. B. Extracellular matrix remodeling and organization in developing and diseased aortic valves. Circulation research. 98, 1431-1438 (2006).
- Gould, S. T., Srigunapalan, S., Simmons, C. A., Anseth, K. S. Hemodynamic and cellular response feedback in calcific aortic valve disease. Circulation research. 113, 186-197 (2013).
- Bosse, K., et al. Endothelial nitric oxide signaling regulates Notch1 in aortic valve disease. Journal of molecular and cellular cardiology. 60, 27-35 (2013).
- Laforest, B., Andelfinger, G., Nemer, M. Loss of Gata5 in mice leads to bicuspid aortic valve. The Journal of clinical investigation. 121, 2876-2887 (2011).
- Hofmann, J. J., et al. Endothelial deletion of murine Jag1 leads to valve calcification and congenital heart defects associated with Alagille syndrome. Development. 139, 4449-4460 (2012).
- Wylie-Sears, J., Aikawa, E., Levine, R. A., Yang, J. H., Bischoff, J. Mitral valve endothelial cells with osteogenic differentiation potential. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 31, 598-607 (2011).
- Gould, R. A., Butcher, J. T. Isolation of valvular endothelial cells. Journal of Visualized Experiments : JoVE. , (2010).
- Butcher, J. T., Penrod, A. M., Garcia, A. J., Nerem, R. M. Unique morphology and focal adhesion development of valvular endothelial cells in static and fluid flow environments. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 24, 1429-1434 (2004).
- Cheung, W. Y., Young, E. W., Simmons, C. A. Techniques for isolating and purifying porcine aortic valve endothelial cells. The Journal of heart valve disease. 17, 674-681 (2008).
- Motoike, T., et al. Universal GFP reporter for the study of vascular development. Genesis. 28, 75-81 (2000).
- Peacock, J. D., Lu, Y., Koch, M., Kadler, K. E., Lincoln, J. Temporal and spatial expression of collagens during murine atrioventricular heart valve development and maintenance. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 237, 3051-3058 (2008).
- Levay, A. K., et al. Scleraxis is required for cell lineage differentiation and extracellular matrix remodeling during murine heart valve formation in vivo. Circulation research. 103, 948-956 (2008).
- Lincoln, J., Alfieri, C. M., Yutzey, K. E. BMP and FGF regulatory pathways control cell lineage diversification of heart valve precursor cells. Developmental biology. 292, 292-302 (2006).
- Wu, B., et al. Nfatc1 coordinates valve endocardial cell lineage development required for heart valve formation. Circulation research. 109, 183-192 (2011).
