Etkin Killer yapay antijen sunan hücreler (KaAPC)<em> İn Vitro</em> İnsan Antijen-spesifik T hücrelerinin tükenmesi

HLA-A2-lg Tabanlı KaAPC 1. Üretimi Steril borat tamponu hazırlayın. Su içinde borik asit içindeki bir 0.1 M bir solüsyon yapmak ve 7.0 pH değerinin ayarlanması. Steril filtre (0.22 um) tamponu ve 4 ° C'de saklayın. Steril boncuk yıkama tamponu hazırlayın. Magnezyum ve kalsiyum içermeyen fosfat tamponlu serum fizyolojik (PBS) kullanılır. % 3 nihai konsantrasyon, insan AB serumu ekleyin. 2 mM nihai konsantrasyon için etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ilave edin. % 0.01 nihai konsantrasyona sodyum azid (NaN3) ekleyin. Steril filtre (0.22 um) tamponu ve 4 ° C'de saklayın. Steril içine stoktan epoksi boncuklar (yaklaşık 100 x 10 6 boncuk) 250 ul aktarın, cam tüpe vida. Borat tampon 250 ul ilave edin. Bir mıknatıs cam şişeyi koyun ve boncuk 2 dakika uymak edelim; aspirat tampon ve mıknatıstan cam şişeyi çıkarın. 1 ml borat tamponu ile bir kez boncuk yıkayın. 0.018 mcg 550 ul içine süspanse boncuklar/ Ml HLA-A2-lg ve 3.64 ug / ml anti-insan CD95 mAb (klon CH11) ve hafifçe sallanarak karıştırılır. (Ek bilgi için tartışma bölümüne bakınız.) 24 saat boyunca 4 ° C 'de, ucuna bir döndürücü ucunda cam tüpe inkübe edin. 2 dakika boyunca 300 xg'de boncuk aşağı doğru döndürün. 2 dakika için bir mıknatıs üzerine cam şişe yerleştirin ve "KaAPC yükleme çözüm" aspire; , mıknatıs cam flakonun çıkarılması boncuk yıkama tamponu 1 ml ekleyin ve sallayarak dikkatle tekrar süspansiyon. Adımı yineleyin 1.10 iki kez. 1 mi boncuk yıkama tampon maddesi içinde, 24 saat boyunca 4 ° C 'de, bir döndürücü üzerinde cam tüpe inkübe edin. Bu noktada, tüm bağlanma yerleri artan protein boncuk yıkama tamponu içinde bulunan insan AB serumu ile bloke edilir. 2 dakika boyunca 300 xg'de boncuk aşağı doğru döndürün. Yer cam 2 dakika ve aspire boncuk yıkama tamponu için bir mıknatıs üzerine flakon; mıknatıstan cam tüpe çıkarın ve 1 ml PBS ile bir çözüm yerine. 2. Kalite Kontrol, Peptide Yükleme, Wkülleme, Depolama ve KaAPC Kararlılık Bir FACS tüpü içine, 1.5 x 10 5 KaAPC aktarın ve FACS yıkama tamponu 1 ml ile yıkayın. Tampon ve tespiti için, ve anti-fare IgM FITC (klon R6-60.2 1 ul (HLA-A2-Ig Fc bölümü tespiti için), anti-fare IgG1 PE 1 ul yıkama 100 ul FACS içinde süspanse boncuk anti-insan CD95 mAb). Tampon ve akış sitometrisi ile lekeleme yıkama oku 250 ul FACS 1 ml FACS yıkama tamponu ve tekrar süspansiyon ile yıkayınız, 4 ° C'de 15 dakika boyunca inkübe edin. Protokol bölümünde belirtildiği gibi yapılan bir KaAPC toplu Şekil 1. QC lekesi. Lekelenmesi anti-insan CD95 ise, 2. HLA-A2-lg bir anti-fare-PE IgG1 mAb protokolü kullanılarak tespit edilmiştir bölümünde tarif edildiği gibi gerçekleştirildi (anti-Fas) (se protokolüne bir anti-fare-FITC ile IgM mAb ile saptandıavranış 2.2) (mavi çizgi). Dolgulu siyah grafikler, sırasıyla anti-fare-PE IgG1 mAb ya da anti-fare FITC-lgM mAb ile lekelenmiş, boş boncuklar temsil eder. Sağ üst köşedeki sayılar ortalama floresan yoğunluğu (MFI) gösterir. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. Yeni bir steril cam şişenin içine peptid yükleme devri 20 x 10 6 KaAPC için, 2 dakika boyunca bir mıknatıs üzerine yerleştirin, 5 ug peptit ile 500 ul taze PBS içine aspire PBS ve tekrar süspansiyon boncuk (Unutmayın, sadece HLA-A2 kısıtlı peptidler olacak dimer üzerine bağlanan!). Mağaza HLA-A2-lg dimer üzerine yeterli bir peptit yüklenmesine olanak sağlamak üzere, en az 3 gün süre ile, kullanılana kadar 4 ° C 'de KaAPC yüklendi. Kullanımdan hemen önce, 1,14 belirtildiği gibi KaAPC yüklenen peptidi yıkama; Bu adımı en az 6x tekrarlayın. NOT: Bu ücretsiz peptid t sahip olmasını sağlamak için önemli bir adımdıro yalancı pozitif öldürme sonuçları önlemek için tamamen çıkarılmalıdır; artık serbest peptid antijene özgü T hücre kültürlerinin 9 apoptosisi teşvik ettiği gösterilmiştir. Çözünebilir peptid etkisini ortadan kaldırabilmek için, yüklenen peptid süpernatant kontrol örnekleri çalıştırmak ve KaAPC (3.8 bakınız) yıkandı. Hemasitometre kullanarak boncuk saymak ve peptit ve konsantrasyon tarih, adı ile etiketleyin. NOT: Yüklü KaAPC en az bir ay boyunca 4 ° C 'de işlevsel kalır. Bir ay sonra, aynı peptid ile yeniden yükleme KaAPC bir yıla kadar kullanılmasını sağlar. 3. KaAPC İn Vitro Öldürme Deneyi Ko-kültür ortamı hazırlayın. Ve% 3 otolog plazma verici (laboratuarda yapılan 6) 3% T hücre büyüme faktörü ile desteklenmiş tam RPMI ortamı hazırlayın. Donör otolog plazma mevcut değilse, ısı ile inaktive edilmiş insan AB serumu kullanın. AnnexinV bağlama tamponu hazırlanmasını hazırlayın. 8.12 g sodyum klorür (NaCI) ve 0.12 g kireci çözündürün990 mi ile kombine edilmiştir 2'ye amonyum klorür (CaCl2), 10 ml 1 M HEPES tamponu O.Add. Insan antijen-spesifik T hücrelerini oluşturur. (Ayrıntılı bir protokol için yapay antijen sunan hücreler (aAPC) kullanan bir önceki yayını 7 bakınız). Bu peptid özgünlüğü tetramer boyama ile saptandığı haliyle en azından>% 75 olduğundan emin olun. Nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 48 saat boyunca KaAPC 1 oranında, 37 ° C de Her numune için, 2 x 10 5 antijene spesifik T hücre / göz (96 yuvarlak tabanlı plaka içindeki), 1 ortak-kültür ortamı içinde 200 ul inkübe C ve% 5 CO2. Hasat örnekler ve bir FACS tüpü içine transferi; 1 ml bağlayıcı tampon ile AnnexinV yıkama 5 dakika boyunca 300 xg'de spin AnnexinV bağlayıcı tampon 100 ul supernatant ve tekrar süspansiyon atmak 1 ul AnnexinV FITC ve oda sıcaklığında 10-15 dakika boyunca 5 ul 7-AAD ile Leke örnekleri, 1 mi AnnexinV bağlama tamponu ile yıkama; , 5 dakika boyunca 300 xg'de dönme üst sıvı bir atın250 ul AnnexinV bağlama tamponu içinde tekrar süspansiyon d Akış sitometresi örnekleri hemen okuyun. KaAPC antijen spesifik öldürmeyi belirlemek için aşağıdaki örnekleri hazırlayın: T hücrelerinin sadece; + T hücreleri, çözünür anti-CD95; T hücreleri boşaltılmış KaAPC +; T hücreleri + olmayan soydaş peptid KaAPC yüklenir; T hücreleri, ortak kökenli + peptid KaAPC yüklenir; Ortak kökenli peptitin T hücreleri + yüzer KaAPC yüklendi. ., CMVpp65 spesifik T hücreleri (~% 80) 1 oranında, hasat edilmiş ve daha sonra AnnexinV ile boyanmıştır: Şekil 2. KaAPC öldürme deneyi bir Peptid 1 de 48 saat süre ile kültüre KaAPC ya da kontrol boncuk (HLA-A2-lg sadece boncuk) yüklendi edildi ve propidyum iyodür (PI). flow sitometri (bkz protokol bölüm 3.3-3.7) tarafından "soydaş" apopitozun olmak "non-soydaş" CMVpp65 ve yüklü boncuk atıfta içinMart-1 peptid ile yüklü reklamlar. Sayılar her arsa sol alt kadranda canlı T hücrelerinin yüzdesini göstermektedir. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. , Çapraz-deneyler yaparak, iki farklı özelliklerin antijene-özgü T hücrelerinin üretilmesi için. Bundan başka, T hücre popülasyonunun heterojen T hücrelerinin antijene özgü bir eleme analizi ile eşzamanlı KaAPC antijene spesifik tükenmesinin-yeteneklerini değerlendirmek. (Ayrıntılı bir protokol için Schütz ark bakınız. 10).