効率的なためキラー人工抗原提示細胞（KaAPC）<em>体外</em>ヒト抗原特異的T細胞の枯渇

HLA-A2-IgをベースKaAPCの1世代無菌のホウ酸緩衝液を準備します。水中のホウ酸の0.1M溶液を作成し、pHを7.0に調整。無菌フィルター（0.22μm）をバッファリングし、4℃で保存する。 無菌のビーズ洗浄バッファーを準備します。マグネシウムおよびカルシウムなしでリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を使用。 3％の最終濃度のためのヒトAB血清を追加します。 2mMの最終濃度のためにエチレンジアミン四酢酸（EDTA）を加える。 0.01％の最終濃度のためにアジ化ナトリウム（NaN 3を ） を加える。無菌フィルター（0.22μm）をバッファリングし、4℃で保存する。 無菌に在庫からのエポキシビーズ（約100×10 6ビーズ）を250μlを移し、トップガラスバイアルスクリュー。 ホウ酸緩衝液を250μlを追加。 磁石の上ガラスバイアルを入れて、ビーズを2分間付着させ;吸引バッファと磁石からガラスバイアルを取り外します。 1ミリリットルホウ酸緩衝液で1回ビーズを洗浄する。 0.018μgの550μlの中に再懸濁ビーズ/ mlのHLA-A2-Igおよび3.64 / mlの抗ヒトCD95モノクローナル抗体（クローンCH11）と軽く振り混ぜる。 （詳細については、議論のセクションを参照してください。） 24時間、4℃で、端部の上に回転子の端にガラスバイアルをインキュベートする。 2分間300×gでビーズをスピンダウン。 2分間磁石上にガラスバイアルを置き、「KaAPC負荷溶液」を吸引する。磁石からガラスバイアルを取り外し、ビーズ洗浄緩衝液1mlを加え、振とうして、慎重に再懸濁する。 二回ステップ1.10を繰り返します。 1ミリリットルビーズ洗浄緩衝液中で24時間、4℃で回転装置上ガラスバイアルをインキュベートする。この時点で、結合部位を全ての残留タンパク質は、ビーズ洗浄緩衝液に含まれるヒトAB血清によってブロックされる。 2分間300×gでビーズをスピンダウン。 2分と吸引ビーズ洗浄バッファー用の磁石の上に置きガラスバイアル;磁石からガラスバイアルを除去し、1mlのPBSで溶液を交換してください。 2品質管理、ペプチド負荷、Wアッシング、ストレージ、およびKaAPCの安定性 FACSチューブに1.5×10 5 KaAPCを移し、FACSバッファを洗う1ミリリットルで洗浄する。 100μlのFACSに再懸濁ビーズ（HLA-A2-IgのFc部分を検出するための）抗マウスIgG1 PEを1μlおよび検出のための抗マウスIgM FITC（クローンR6-60.2、1μlのをバッファリングし、追加の洗浄抗ヒトCD95 mAbの）。 FACSバッファーを洗浄し、250μlのFACSでの再懸濁は、フローサイトメトリーによって染色をバッファリングし、読んで洗う1ミリリットルで洗浄し、4℃で15分間インキュベートする。 プロトコルの項で述べたように作られKaAPCバッチの図1のQC染色剤。染色は、抗ヒトCD95のに対し、2 HLA-A2-Igは抗マウスIgG1のPEモノクローナル抗体を用いて検出したプロトコルの項に記載したように行った（抗Fas）（プロトコル自体を参照して抗マウスIgMをFITC mAbで検出されました2.2 ction）（青線）。充填された黒色のグラフは、それぞれ、抗マウスIgG1のPE mAbまたは抗マウスIgMをFITC mAbで染色された空のビーズを表す。右上の数字は、平均蛍光強度（MFI）を示す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 新しい滅菌ガラスバイアルにペプチド積載転送20×10 6 KaAPCのために、2分間磁石上に置き、5μgのペプチドを有する500μlの新しいPBSに吸引PBS再懸濁ビーズは（覚えておいて、唯一のHLA-A2制限ペプチドは意志二量体に結合すること！）。 ストアは、HLA-A2-Ig二量体への十分なペプチド負荷を可能にするために、少なくとも3日間、使用するまで4℃でKaAPCをロードしました。 使用直前に、1.14に示されるようにKaAPCをロードしたペプチドを洗浄し;少なくとも6倍、この手順を繰り返します。 注：これは遊離ペプチドがtを有することを保証するために重要なステップです。oが偽陽性の殺傷の結果を避けるために完全に除去すること;残留遊離ペプチドは、抗原特異的T細胞培養9においてアポトーシスを誘導することが示されている。可溶性ペプチドの効果を除外するために、ペプチドの実行上清対照サンプルがロードされ、（3.8を参照）KaAPC洗浄した。 血球計数器を用いてビーズを数え、ペプチドと集中の日付、名前でラベルを付けます。 注：ロードされたKaAPCは少なくとも1ヶ月間、4℃で機能している場合。 1ヶ月後、同じペプチドでの再ロードはKaAPCは、1年のために利用することができます。 3 KaAPC 体外キリングアッセイ共培養培地を準備します。 （実験室6製）3％T細胞増殖因子および3％ドナー自家血漿を添加した完全RPMI培地を調製する。ドナー自己血漿が使用できない場合は、熱不活性化ヒトAB血清を使用しています。 アネキシンV結合緩衝液の準備を準備します。 8.12グラムの塩化ナトリウム（NaCl）および0.12グラムの計算値を溶かす990ミリリットルののddH 2にイウムクロライド（のCaCl 2）を 10mlの1M HEPES緩衝液をO.Add。 ヒト抗原特異的T細胞を生成する。 （詳細なプロトコールについては、人工抗原提示細胞（aAPCを）利用する前の出版物7を参照してください）。四量体染色によって決定されるように、ペプチド特異性は、少なくとも> 75％であることを確認してください。 加湿インキュベーター中で48時間KaAPC 1比率37℃で：各試料について、2×10 5抗原特異的T細胞/ウェル（96ウェル丸底プレート中の）1での共培養培地200μl中でインキュベートC、5％CO 2。 収穫サンプルおよびFACSチューブに移す。 、1ミリリットルアネキシンV結合緩衝液で洗浄し、5分間300×gでスピンダウン、アネキシンV結合緩衝液100μlの上清と再懸濁を捨てる RTで10〜15分間、1μlのアネキシンV FITCおよび5μlの7-AADで染色サンプルは、1ミリリットルアネキシンV結合緩衝液で洗浄する。 5分間300×gでスピンダウン、上澄みANを捨てる250μlのアネキシンV結合緩衝液中のd再懸濁フローサイトメーター上で直ちにサンプルをお読みください。 以下KaAPCにより抗原特異的な死滅を決定するためのサンプルの準備：T細胞のみ; T細胞+可溶性抗CD95; T細胞はKaAPCアンロード+; KaAPCロードされたT細胞は、+非同族ペプチド; T細胞+同族のペプチドはKaAPCをロードした。同族のペプチドのT細胞+上清をKaAPCをロードしました。 アッセイを殺す図2 KaAPCペプチドは1から48時間培養した（HLA-A2-Igのビーズのみ）KaAPCまたはコントロールビーズをロードした：回収し、その後アネキシンVで染色し、CMVpp65特異的T細胞（〜80％）と1の比率フローサイトメトリーによってアポトーシスを測定するためにヨウ化物（PI）プロピジウム（プロトコルセクション3.3から3.7を参照）。「コグネイト」はであることがCMVpp65および「非同族"で撮影されたビーズを指しMART-1ペプチドをロードした広告。数字は各プロットの左下の象限中の生存T細胞の割合を示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 十字、実験を行うために、2つの異なる特異性の抗原特異的T細胞を生成する。 さらに不均一なT細胞集団におけるT細胞の抗原特異的排除の同時分析をKaAPCの抗原特異的な空乏能力を評価する。 （詳細なプロトコールについてシュッツらを参照してください。10）。