Ex Vivo הכנות של הנורה Vomeronasal האיברים ואבזר חוש הריח הפגועה
Summary
הנורה עכבר חוש הריח אבזר (AOB) כבר קשה ללמוד בהקשר של קידוד חושי. הנה, אנחנו מדגימים נתיחה שמייצרת vivo הכנה לשעבר שבו נוירונים AOB יישארו תפקודי מחוברים לתשומות ההיקפית שלהם, ומקלים על מחקרים בתחום עיבוד מידע של פרומונים העכבר וkairomones.
Abstract
מערכת עכבר חוש הריח אבזר (AOS) היא מסלול חושי מיוחד לאיתור ריחות בלתי נדיף חברתיים, פרומונים, וkairomones. המעגל העצבי הראשון במסלול AOS, הנקרא הנורה חוש הריח האבזר (AOB), ממלא תפקיד חשוב בקביעת התנהגויות מיניות אופיינית כמו תוקפנות והזדווגות טריטוריאליות. מעגל זה קטן (<1 מ"מ 3) הוא בעל היכולת להבחין מדינות התנהגותיים ייחודיות, כגון מין, מתח, ולחץ מרמזי chemosensory בהפרשות והפרשות של בני מין. בעוד הארגון הקומפקטי של מערכת זו מציג הזדמנויות ייחודיות להקלטה מחלקים גדולים של המעגל בו זמנית, החקירה של עיבוד חושי בAOB נותרת מאתגרת, בעיקר בשל המיקום בניסוי הנחות שלו במוח. הנה, אנחנו מדגימים נתיחה רב שלבים שמסירה את AOB ללא פגע בתוך אונה אחת של גולגולת העכבר הקדמית, והשאיר להתחבריונים לשני נוירונים vomeronasal ההיקפי חושיים (VSNs) ומעגלים עצביים המקומיים בשלמותה. ההליך חושף את פני השטח AOB לכוון בדיקה חזותית, בהנחיית אלקטרו והקלטות אופטיות מרכיבי מעגל AOB בהיעדר חומרי הרדמה. עם החדרת צינורית דקה לתוך איבר vomeronasal (VNO), אשר בתי VSNs, אפשר ישירות לחשוף את הפריפריה לריחות חברתיים ופרומונים בעת הקלטת פעילות במורד הזרם בAOB. הליך זה מאפשר לבירורים מבוקרים לעיבוד מידע AOS, אשר יכול לשפוך אור על מנגנונים המקשרים חשיפת פרומון לשינויים בהתנהגות.
Introduction
עיבוד חושי במוח היונקים בדרך כלל משתרע על פני מעגלים עצביים הדדי המחובר מרובים, כל אחד מהם תמציות תכונות מסוימות מקלט חושי. במסלולים חושיים, עיבוד מידע מוקדם הוא חיוני לתפיסה והתנהגות נורמליות. במערכת ההרחה האבזר (AOS), הנורה חוש הריח האבזר (AOB) היא המעגל העצבי העיקרי המקשר את הפריפריה החושית למבנים במורד הזרם שמכתיבים את איזון ההורמונלי 1,2, תוקפנות 3, ועורר 4. ככזה, עיבוד מידע בתוך מעגל זה קשור מאוד לשינויים בהתנהגות בעלי חיים.
הנורה חוש הריח האבזר ממוקמת בעכברים וחולדות בהיבט גב / הזנב / האחורי של הנורה העיקרית חוש הריח (MOB) מתחת הצפוף, vascularized סינוס rhinal. AOB מקבל עצבוב מביא מהאקסונים של תאי עצב ההיקפי vomeronasal החושי (VSNs) שמתגוררים באיבר vomeronasal (VNO), smal צינור עיוור הסתיים ליטר בחוטם הקדמי בדיוק מעל החיך הרך. אקסונים אלה חוצים את הסדין העדין של רקמה במחיצה בגבול המדיאלי של מעברי האף. מספר מחקרים בחנו תגובות עצביות AOB למקורות של ריחות AOS (כגון שתן עכבר) in vivo באמצעות עכברים מורדמים 5-7 או בעלי חיים באופן חופשי, לחקור 8. הגבורה הרדימה במחקרי vivo המעורבים (א) tracheotomies כדי להבטיח הרדמה עמוקה ולמנוע את השאיפה של גירויים נוזליים 5-7, (ב) גירוי של גנגליון האוהד צוואר הרחם 6 או cannulation הישיר של איבר vomeronasal 5,7 להציג את ריחות בלתי נדיף ו (ג) craniotomies עם או בלי כריתת אונה קדמית כדי לאפשר קידום אלקטרודה לתוך AOB 6. ער / מתנהג מחקרים 8-10 השתלה כירורגית מעורבת של דיסק קשיח זעירה. לסיכום, פרדיגמות ניסוי אלה הן רבות עוצמה, אבל קשות מאוד ולעתים קרובות דורשות הרדמה.
<p class = "jove_content"> מעניין לציין, כי מספר מחקרים ניסו לשמור על מבנים חושיים ומעגלים עצביים במורד הזרם בחיים מחוץ לגוף (ex vivo) בהצלחה מסוימת 11-15. בגלל הקשרים בין VNO וAOB יישארו ipsilateral, ובגלל הרקמה במחיצה קו האמצע יכולה להיות חשופה לsuperfusate מחומצן בחצי כדור בודד, בקשנו לפתח vivo לשעבר גישה כזו חד אונה לבודד מבנים אלה תוך שמירה על הקישוריות התפקודית שלהם. הצלחנו לאחרונה בהשגת מטרה זו 16. הכנה זו שומרת VNO וAOB החיים ותפקודיים מחובר לפחות 4 שניהם – 6 שעות, כי שניהם אקסונים (יחד הרקמות רכות במחיצה קו האמצע) וAOB הם רדודים יחסית <600 מיקרומטר תכונות שאינן נגישים לsuperfused מלאכותי נוזל השדרתי מחומצן ( aCSF). vivo לשעבר הכנת VNO-AOB זה מאפשרת כניסתה של גירויים מבוקרים לתוך VNO באמצעות צינורית דקה, וגישה ויזואלית ישירה לAOB הקטן למיקום האלקטרודה ממוקד ו / או מיקרוסקופ פלואורסצנטי החי. בשיטה זו יש יתרון אם אחד רצונות ללמוד מעגלים אלה בהיעדר חומרי הרדמה. בגלל גישה זו מנתקת קשרי צנטריפוגלי, הוא לא מתאים גם לפניות לאפנון צנטריפוגלי של תפקוד AOB. Vivo לשעבר הכנת VNO-AOB קשה ללמוד, אבל השיג פעם אחת מייצר פלטפורמה אמינה שעליו לחקור את הארגון במעגל, עיבוד מידע, ופלסטיות עצבית במעגל החושי רב עוצמה הזה.Protocol
Representative Results
Discussion
Vivo לשעבר הכנת VNO-AOB המתואר בפרוטוקול זה היא אלטרנטיבה יעילה להרדמת in vivo 5-7 ופרוסה חיות חריפה 17 ניסויים של תפקוד AOB. בניגוד לניסויי פרוסת AOB חריפים, שגם חושפים את רכיבי מעגל עבור קלטות אלקטרו אופטיות, הכנה זו שומרת על כל afferents החושית וקשרי התוך AOB. למר?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי r00 DC011780 (JPM: NINDS, NIH), F30 DC011673 (בית לוחמי הגטאות: NINDS, NIH) ובקרנות UT Southwestern הפעלה (JPM).
Materials
| Straight Scissors | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| Fine Scissors-Straight | Fine Science Tools | 14060-10 | |
| Fine Scissors-Curved | Fine Science Tools | 14061-10 | |
| Adson Forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| #3 Scalpel Handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| #11 Scalpel Blades | Fisher Scientific | 3120030 | |
| Straight Carbon Steel Razor Blades | Fisher Scientific | 12-640 | |
| 35 mm Petri Dish | Fisher Scientific | 08-772-21 | |
| Dissection Chamber | Custom | N/A | See Fig. 1 |
| Delrin plastic plank 0.6 cm x 1.5 cm x 0.1 cm | Custom | N/A | |
| Dow Corning Silicon Vacuum grease | Fisher Scientific | 146355D | |
| #5 Forceps, Student | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| #5 Forceps, Biologie Tip | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| #5 Forceps, Student | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| 0.0045" Polyimide Tubing | A-M Systems | 823400 | |
| 1/16" Male Luer | Cole-Parmer | EW-45505-00 | |
| 1/16" Tubing | Fisher Scientific | 14-171-129 | |
| Two ton epoxy | Grainger | 5E157 | |
| ValveBank Pressurized Perfusion Kit | AutoMate Scientific | 09-16 | |
| ValveLink digital/manual controller | AutoMate Scientific | 01-18 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | various | |
| KCl | Sigma-Aldrich | various | |
| CaCl2 dihydrate | Sigma-Aldrich | various | |
| MgCl2 hexahydrate | Sigma-Aldrich | various | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | various | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | various | |
| myo-inositol | Sigma-Aldrich | various | |
| Na-pyruvate | Sigma-Aldrich | various | |
| Na-ascorbate | Sigma-Aldrich | various | |
| HEPES buffer | Sigma-Aldrich | various | |
| glucose | Sigma-Aldrich | various |
References
- Bruce, H. M. An exteroceptive block to pregnancy in the mouse. Nature. 184, 105 (1959).
- Bellringer, J. F., Pratt, H. P., Keverne, E. B. Involvement of the vomeronasal organ and prolactin in pheromonal induction of delayed implantation in mice. J Reprod Fertil. 59, 223-228 (1980).
- Bean, N. J. Modulation of agonistic behavior by the dual olfactory system in male mice. Physiol Behav. 29, 433-437 (1982).
- Meredith, M. Vomeronasal organ removal before sexual experience impairs male hamster mating behavior. Physiol Behav. 36, 737-743 (1986).
- Hendrickson, R. C., Krauthamer, S., Essenberg, J. M., Holy, T. E. Inhibition shapes sex selectivity in the mouse accessory olfactory bulb. J Neurosci. 28, 12523-12534 (2008).
- Ben-Shaul, Y., Katz, L. C., Mooney, R., Dulac, C. In vivo vomeronasal stimulation reveals sensory encoding of conspecific and allospecific cues by the mouse accessory olfactory bulb. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, (2010).
- Tolokh, I. I., Fu, X., Holy, T. E. Reliable sex and strain discrimination in the mouse vomeronasal organ and accessory olfactory bulb. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 13903-13913 (2013).
- Luo, M., Fee, M. S., Katz, L. C. Encoding pheromonal signals in the accessory olfactory bulb of behaving mice. Science. 299, 1196-1201 (2003).
- Binns, K. E., Brennan, P. A. Changes in electrophysiological activity in the accessory olfactory bulb and medial amygdala associated with mate recognition in mice. Eur J Neurosci. 21, 2529-2537 (2005).
- Leszkowicz, E., et al. Noradrenaline-induced enhancement of oscillatory local field potentials in the mouse accessory olfactory bulb does not depend on disinhibition of mitral cells. Eur J Neurosci. 35, 1433-1445 (2012).
- Ames, A., Gurian, B. S. Electrical Recordings from Isolated Mammalian Retina Mounted as a Membrane. Arch Ophthalmol. 70, 837-841 (1963).
- Flock, A. F., Strelioff, D. Studies on hair cells in isolated coils from the guinea pig cochlea. Hear Res. 15, 11-18 (1984).
- Woodbury, C. J., Ritter, A. M., Koerber, H. R. Central anatomy of individual rapidly adapting low-threshold mechanoreceptors innervating the ‘hairy’ skin of newborn mice: early maturation of hair follicle afferents. J Comp Neurol. 436, 304-323 (2001).
- Llinas, R., Muhlethaler, M. An electrophysiological study of the in vitro, perfused brain stem-cerebellum of adult guinea-pig. The Journal of physiology. 404, 215-240 (1988).
- Riviere, S., Challet, L., Fluegge, D., Spehr, M., Rodriguez, I. Formyl peptide receptor-like proteins are a novel family of vomeronasal chemosensors. Nature. 459, 574-577 (2009).
- Meeks, J. P., Holy, T. E. An ex vivo preparation of the intact mouse vomeronasal organ and accessory olfactory bulb. J Neurosci Methods. 177, 440-447 (2009).
- Leinders-Zufall, T., et al. Ultrasensitive pheromone detection by mammalian vomeronasal neurons. Nature. 405, 792-796 (2000).
- Kato, H. K., Chu, M. W., Isaacson, J. S., Komiyama, T. Dynamic sensory representations in the olfactory bulb: modulation by wakefulness and experience. 76, 962-975 (2012).
- Meeks, J. P., Arnson, H. A., Holy, T. E. Representation and transformation of sensory information in the mouse accessory olfactory system. Nature. 13, 723-730 (2010).
