Ex Vivo preparati della lampadina vomeronasale Organo e accessori olfattivo intatto
Summary
L'accessorio bulbo olfattivo mouse (AOB) è stato difficile studiare nel contesto della codifica sensoriale. Qui, dimostriamo una dissezione che produce un vivo preparazione franco in cui i neuroni AOB rimangono funzionalmente collegati agli ingressi periferici, facilitando la ricerca di elaborazione delle informazioni dei feromoni mouse e cairomoni.
Abstract
Il sistema olfattivo accessorio mouse (AOS) è un percorso sensoriale specializzato per rilevare gli odori volatili sociali, feromoni, e cairomoni. Il primo circuito neurale nel pathway AOS, chiamato il bulbo olfattivo accessorio (AOB), svolge un ruolo importante nello stabilire comportamenti sesso tipico come l'aggressività territoriale e accoppiamento. Questo piccolo circuito (<1 mm 3) possiede la capacità di distinguere gli stati comportamentali unici, come il sesso, tensione, e lo stress da spunti chemiosensoriali nelle secrezioni ed escrezioni di conspecifici. Mentre l'organizzazione compatta di questo sistema offre opportunità uniche per la registrazione da grandi porzioni del circuito contemporaneamente, ricerca di elaborazione sensoriale nel AOB rimane impegnativo, in gran parte dovuto alla sua posizione svantaggiosa sperimentalmente nel cervello. Qui, dimostriamo una dissezione più stadi che rimuove il AOB intatto all'interno di un singolo emisfero del mouse cranio anteriore, lasciando collegareioni ad entrambi i vomeronasali periferica neuroni sensoriali (VSNs) e circuiti neuronali locali intatti. La procedura espone la superficie AOB dirigere ispezione visiva, facilitando elettrofisiologica e registrazioni ottiche da elementi circuitali AOB in assenza di anestetici. Dopo l'inserimento di una cannula sottile nell'organo vomeronasale (VNO), che ospita le VSNs, si può esporre direttamente la periferia agli odori sociali e feromoni durante la registrazione di attività a valle nella AOB. Questa procedura consente indagini controllate in AOS elaborazione delle informazioni, che possono far luce sui meccanismi che legano l'esposizione feromone a cambiamenti nel comportamento.
Introduction
Elaborazione sensoriale nel cervello dei mammiferi si estende in genere più circuiti neuronali reciprocamente collegate, ciascuna delle quali estrae particolari caratteristiche da input sensoriali. In percorsi sensoriali, elaborazione delle informazioni precoce è di vitale importanza per la percezione e il comportamento normale. Nel sistema olfattivo accessorio (AOS), il bulbo olfattivo accessorio (AOB) è il principale circuito neurale che collega la periferia sensoriale alle strutture a valle che determinano l'equilibrio ormonale 1,2, aggressività 3, e l'eccitazione 4. Come tale, l'elaborazione delle informazioni all'interno di questo circuito è fortemente legata ai cambiamenti nel comportamento animale.
Il bulbo olfattivo accessorio è situato in topi e ratti nella parte dorsale / caudale / posteriore del bulbo olfattivo principale (MOB) sotto la fitta, vascolarizzato seno rhinal. L'AOB riceve afferente innervazione da assoni dei neuroni sensoriali vomeronasali periferico (VSNs) che risiedono nell'organo vomeronasale (VNO), un small tubo cieco-ended nel muso anteriore, appena sopra il palato molle. Questi assoni attraversano il delicato strato di tessuto settale al confine mediale dei passaggi nasali. Diversi studi hanno sondato AOB risposte neurali alle fonti di odori AOS (come l'urina del mouse) in vivo utilizzando topi anestetizzati 5-7 o animali liberamente esplorare 8. L'eroico anestetizzati studi in vivo coinvolti (a) tracheotomia per garantire l'anestesia profonda e prevenire l'aspirazione di stimoli liquido 5-7, (b) stimolazione del ganglio cervicale simpatico 6 o incannulamento diretta dell'organo vomeronasale 5,7 per introdurre gli odori volatili e (c) craniotomie con o senza ablazione del lobo frontale per consentire elettrodo avanzamento nella AOB 6. Awake / comportarsi studi 8-10 coinvolti impianto chirurgico di un microdrive. In sintesi, questi paradigmi sperimentali sono potenti, ma estremamente difficile e spesso richiedono l'anestesia.
<p class = "jove_content"> Interessante, diversi studi ha cercato di mantenere strutture sensoriali e circuiti neurali valle vive al di fuori del corpo (ex vivo) con un certo successo 11-15. Poiché i collegamenti tra il VNO e AOB rimangono omolaterale, e perché il tessuto linea mediana del setto può essere esposto a superfusate ossigenato in un singolo emisfero, abbiamo cercato di sviluppare un ex vivo approccio unico emisfero isolare queste strutture pur mantenendo la loro connettività funzionale. Recentemente siamo riusciti a raggiungere questo obiettivo 16. Questa preparazione mantiene sia il VNO e AOB vivo e funzionalmente collegato per almeno 4-6 ore perché entrambi gli assoni (lungo la linea mediana del setto tessuti molli) e AOB sono relativamente poco profonde <600 micron caratteristiche che sono accessibili a superfuse ossigenato liquido cerebrospinale artificiale ( aCSF). Questo ex vivo preparazione VNO-AOB permette l'introduzione di stimoli controllati nel VNO tramite una cannula sottile, eaccesso visivo diretto al piccolo AOB per il posizionamento degli elettrodi e / o alla microscopia a fluorescenza diretta. Questo metodo è vantaggioso se la si vuole studiare questi circuiti in assenza di anestetici. Poiché questo approccio recide le connessioni centrifughe, non è adatto a inchieste modulazione centrifuga della funzione AOB. L'ex vivo di preparazione VNO-AOB è difficile da imparare, ma una volta raggiunto produce una piattaforma affidabile su cui indagare l'organizzazione del circuito, elaborazione delle informazioni, e la plasticità neurale in questo circuito sensoriale potente.Protocol
Representative Results
Discussion
L'ex vivo di preparazione VNO-AOB descritto in questo protocollo è una valida alternativa alla anestetizzato in vivo 5-7 e acuta fetta vivo 17 esperimenti di funzione AOB. A differenza acuti esperimenti fetta AOB, che espongono anche elementi circuitali per le registrazioni elettrofisiologiche e ottici, questa preparazione conserva tutte le afferenze sensoriali e collegamenti intra-AOB. Anche se questo può anche essere detto di anestetizzato negli approcci vivo, la …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata sostenuta da R00 DC011780 (JPM: NINDS, NIH), F30 DC011673 (GFH: NINDS, NIH) e fondi di avvio UT Southwestern (JPM).
Materials
| Straight Scissors | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| Fine Scissors-Straight | Fine Science Tools | 14060-10 | |
| Fine Scissors-Curved | Fine Science Tools | 14061-10 | |
| Adson Forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| #3 Scalpel Handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| #11 Scalpel Blades | Fisher Scientific | 3120030 | |
| Straight Carbon Steel Razor Blades | Fisher Scientific | 12-640 | |
| 35 mm Petri Dish | Fisher Scientific | 08-772-21 | |
| Dissection Chamber | Custom | N/A | See Fig. 1 |
| Delrin plastic plank 0.6 cm x 1.5 cm x 0.1 cm | Custom | N/A | |
| Dow Corning Silicon Vacuum grease | Fisher Scientific | 146355D | |
| #5 Forceps, Student | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| #5 Forceps, Biologie Tip | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| #5 Forceps, Student | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| 0.0045" Polyimide Tubing | A-M Systems | 823400 | |
| 1/16" Male Luer | Cole-Parmer | EW-45505-00 | |
| 1/16" Tubing | Fisher Scientific | 14-171-129 | |
| Two ton epoxy | Grainger | 5E157 | |
| ValveBank Pressurized Perfusion Kit | AutoMate Scientific | 09-16 | |
| ValveLink digital/manual controller | AutoMate Scientific | 01-18 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | various | |
| KCl | Sigma-Aldrich | various | |
| CaCl2 dihydrate | Sigma-Aldrich | various | |
| MgCl2 hexahydrate | Sigma-Aldrich | various | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | various | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | various | |
| myo-inositol | Sigma-Aldrich | various | |
| Na-pyruvate | Sigma-Aldrich | various | |
| Na-ascorbate | Sigma-Aldrich | various | |
| HEPES buffer | Sigma-Aldrich | various | |
| glucose | Sigma-Aldrich | various |
References
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