Summary

Ex Vivo préparatifs de l'ampoule Vomeronasal organes et accessoire olfactive Intact

Published: August 04, 2014
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Summary

L'ampoule accessoire olfactif de la souris (AOB) a été difficile à étudier dans le contexte du codage sensoriel. Ici, nous démontrons une dissection qui produit in vivo préparation ex dans laquelle les neurones AOB restent fonctionnellement connectées à leurs entrées périphériques, ce qui facilite la recherche en traitement de l'information des phéromones de souris et kairomones.

Abstract

Le système olfactif accessoire de la souris (AOS) est une voie sensorielle spécialisé pour détecter les odeurs non volatiles sociaux, les phéromones, et kairomones. Le premier circuit de neurones dans la voie AOS, appelé le bulbe olfactif accessoire (AOB), joue un rôle important dans l'adoption de comportements sexuels typiques tels que l'agression territoriale et l'accouplement. Ce petit (<1 mm 3) circuit possède la capacité de distinguer des états comportementaux uniques, tels que le sexe, la souche et le stress à partir d'indices chimiosensoriels dans les sécrétions et des excrétions de leurs congénères. Bien que l'organisation de ce système compact offre des possibilités uniques pour l'enregistrement de grandes portions du circuit simultanément, l'enquête du traitement sensoriel dans le AOB reste difficile, principalement en raison de son emplacement expérimentalement désavantageuse dans le cerveau. Ici, nous démontrons une dissection multi-étape qui élimine l'AOB intacte à l'intérieur d'un seul hémisphère du crâne de souris antérieure, laissant connecterions à la fois les voméronasal périphérique neurones sensoriels (VSN) et circuits neuronaux locale intactes. La procédure expose la surface de AOB pour diriger l'inspection visuelle, ce qui facilite les enregistrements électrophysiologiques et optiques à partir des éléments de circuit AOB en l'absence d'anesthésiques. Lors de l'insertion d'une canule fine dans l'organe voméronasal (VNO), qui abrite les VSN, on peut exposer directement la périphérie des odeurs et des phéromones sociaux tout en enregistrant l'activité en aval dans la AOB. Cette procédure permet enquêtes contrôlées dans AOS traitement de l'information, qui peuvent faire la lumière sur les mécanismes reliant l'exposition à la phéromone à des changements de comportement.

Introduction

Traitement sensoriel dans le cerveau des mammifères couvre généralement plusieurs circuits neuronaux réciproquement connectés, chacun extrait les caractéristiques particulières de l'entrée sensorielle. Dans les voies sensorielles, début traitement de l'information est essentielle à la perception et le comportement normal. Dans le système olfactif accessoire (AOS), le bulbe olfactif accessoire (AOB) est le principal circuit neuronal qui relie la périphérie sensorielle aux structures en aval qui dictent l'équilibre hormonal 1,2, 3 agression, et l'excitation 4. En tant que tel, le traitement de l'information au sein de ce circuit est fortement liée à l'évolution du comportement animal.

Le bulbe olfactif accessoire se trouve chez les souris et les rats à l'aspect dorsal / caudale / postérieure du bulbe olfactif principal (MOB) sous la dense, vascularisé sinus rhinal. L'AOB reçoit innervation afférente de axones des neurones sensoriels voméronasal périphérique (VSN) qui résident dans l'organe voméronasal (VNO), un small tube borgne dans le museau antérieure juste au-dessus du voile du palais. Ces axones traversent la feuille sensible de tissu septal à la limite médiale de passages nasaux. Plusieurs études ont sondé les réponses neuronales AOB à des sources d'odeurs AOS (tels que l'urine de la souris) in vivo utilisant des souris anesthésiées 5-7 ou animaux librement explorer 8. L'héroïque anesthésiés dans les études in vivo concernés (a) trachéotomie pour assurer une anesthésie profonde et prévenir l'aspiration des stimuli 5-7 liquide, (b) la stimulation du ganglion sympathique cervical 6 ou canulation directe de l'organe voméronasal 5,7 à introduire les odeurs non volatiles et (c) avec ou sans craniotomies ablations du lobe frontal pour permettre l'avancement dans l'électrode AOB 6. Awake / se comporter études 8-10 implantation chirurgicale impliqués d'une microdrive. En somme, ces paradigmes expérimentaux sont puissants, mais extrêmement difficile et nécessitent une anesthésie souvent.

<p class = "jove_content"> Fait intéressant, plusieurs études a tenté de maintenir des structures sensorielles et les circuits de neurones vivants en aval à l'extérieur du corps (ex vivo) avec un certain succès 11-15. Parce que les liens entre le VNO et AOB restent ipsilatéral, et parce que le tissu médiane septale peut être exposé à superfusat oxygéné dans un seul hémisphère, nous avons cherché à développer une telle approche ex unique de l'hémisphère vivo d'isoler ces structures tout en maintenant leur connectivité fonctionnelle. Nous avons récemment réussi à atteindre cet objectif 16. Cette préparation conserve à la fois le VNO et AOB vivant et relié fonctionnellement au moins 4 – 6 h parce que les deux axones (le long de la ligne médiane tissu septal doux) et AOB sont relativement peu profonds <600 um fonctionnalités qui sont accessibles à superfusées liquide céphalo-rachidien artificiel oxygéné ( aCSF). Cette ex préparation VNO-AOB vivo permet l'introduction de stimuli contrôlés dans le VNO par une canule mince, etun accès visuel direct à la petite AOB pour le placement des électrodes ciblée et / ou microscopie à fluorescence en direct. Ce procédé est avantageux si l'on souhaite étudier ces circuits, en l'absence d'anesthésiques. Parce que cette approche rompt les connexions centrifuges, il n'est pas bien adapté aux demandes de renseignements dans la modulation de la fonction centrifuge AOB. L'ex préparation VNO-AOB vivo est difficile à apprendre, mais une fois atteint produit une plate-forme fiable sur laquelle enquêter sur l'organisation du circuit, le traitement de l'information, et la plasticité neuronale dans ce circuit sensoriel puissant.

Protocol

Toutes les expériences ont été effectuées conformément aux protocoles approuvés par le sud-ouest institutionnel Comité de protection et d'utilisation des animaux UT, et ont été choisis de manière à minimiser le stress, l'inconfort et la douleur ressentie par les animaux de laboratoire. 1. Chambre Dissection Une chambre de dissection personnalisé et petit, mince planche de plastique sont nécessaires pour obtenir les meilleurs résultats …

Representative Results

Atteindre le succès avec cette préparation prend beaucoup de pratique, et a plusieurs étapes à laquelle il peut échouer. On devrait s'attendre à exiger de nombreuses tentatives avant de parvenir à la réussite. La chambre de dissection personnalisé est nécessaire pour la réussite de ce protocole, et doit être obtenue avant de commencer les étapes ultérieures de la dissection. La conception de la chambre présentée sur la figure 1 est suffisante à cette fin, et peut être réalisé en …

Discussion

L'ex préparation VNO-AOB vivo décrite dans ce protocole est une alternative intéressante à anesthésiés in vivo 5-7 et tranche en direct aiguë 17 expériences de la fonction AOB. Contrairement aigus expériences AOB de tranche, qui exposent également des éléments de circuit pour des enregistrements électrophysiologiques et optiques, cette préparation conserve tous les afférences sensorielles et les connexions intra-AOB. Bien que cela peut aussi être dit d…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Cette recherche a été soutenue par R00 DC011780 (JPM: NINDS, NIH), F30 DC011673 (GFH: NINDS, NIH) et les fonds de démarrage UT Southwestern (JPM).

Materials

Straight Scissors Fine Science Tools 14002-14
Fine Scissors-Straight Fine Science Tools 14060-10
Fine Scissors-Curved Fine Science Tools 14061-10
Adson Forceps Fine Science Tools 11006-12
#3 Scalpel Handle Fine Science Tools 10003-12
#11 Scalpel Blades Fisher Scientific 3120030
Straight Carbon Steel Razor Blades Fisher Scientific 12-640
35 mm Petri Dish Fisher Scientific 08-772-21
Dissection Chamber Custom  N/A See Fig. 1
Delrin plastic plank 0.6 cm x 1.5 cm x 0.1 cm Custom  N/A
Dow Corning Silicon Vacuum grease Fisher Scientific 146355D
#5 Forceps, Student Fine Science Tools 91150-20
#5 Forceps, Biologie Tip Fine Science Tools 11295-10
#5 Forceps, Student Fine Science Tools 91150-20
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-08
0.0045" Polyimide Tubing A-M Systems 823400
1/16" Male Luer Cole-Parmer EW-45505-00
1/16" Tubing Fisher Scientific 14-171-129
Two ton epoxy Grainger 5E157
ValveBank Pressurized Perfusion Kit AutoMate Scientific 09-16
ValveLink digital/manual controller AutoMate Scientific 01-18
NaCl Sigma-Aldrich various
KCl Sigma-Aldrich various
CaCl2 dihydrate Sigma-Aldrich various
MgCl2 hexahydrate Sigma-Aldrich various
NaHCO3 Sigma-Aldrich various
NaH2PO4 Sigma-Aldrich various
myo-inositol Sigma-Aldrich various
Na-pyruvate Sigma-Aldrich various
Na-ascorbate Sigma-Aldrich various
HEPES buffer Sigma-Aldrich various
glucose Sigma-Aldrich various

References

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Cite This Article
Doyle, W. I., Hammen, G. F., Meeks, J. P. Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb. J. Vis. Exp. (90), e51813, doi:10.3791/51813 (2014).

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