Выделение, идентификация, и очистка мышиного тимуса эпителиальных клеток
Summary
Здесь мы опишем эффективный метод изоляции, идентификации и очистки мыши тимуса эпителиальных клеток (ТИК). Протокол может быть использован для изучения функции тимуса для нормального развития Т-клеток тимуса, дисфункции и восстановления Т-клеток.
Abstract
Тимус является жизненно важным органом для развития Т-лимфоцитов. Из тимуса стромальных клеток, тимуса эпителиальные клетки (ТИК) имеют особенно важное значение в нескольких этапах развития Т-клеток: Обязательство Т-клеток, положительно отбора и отрицательного отбора. Тем не менее, функция ТИК в тимусе остается полностью поняты. В статье, мы предлагаем способ, чтобы изолировать TEC подмножества из свежего тимуса мыши, используя комбинацию механического разрушения и ферментативного расщепления. Метод позволяет тимуса стромальных клеток и тимоцитов, чтобы быть эффективно выпущен из клетка-клетка и матричных соединений клеток с внеклеточным и образуют единую-клеточной суспензии. Использование изолированных клеток, цитометрии потока многопараметрических могут быть применены к идентификации и характеризации ТИК и дендритных клеток. Потому что ТИК являются редким клеточная популяция в тимусе, мы также описать эффективный способ обогатить и очистить ТИК истощая тимоцитов, самый распространенный тип клеток в тимусе. ФоллоКрыло обогащение, сортировки клеток время может быть уменьшено, так что потери жизнеспособности клеток может быть сведено к минимуму во время очистки ТЭМ. Очищенные клетки пригодны для различных последующих анализов, как Real Time-ПЦР, Вестерн-блоттинга и экспрессии генов профилирования. Протокол будет способствовать исследование функции TEC и, а также развитие в пробирке Т-клеток восстановления.
Introduction
В начале развития Т-клеток, костного мозга гемопоэтических стволовых клеток, полученных предшественники мультипотентные рекрутируются в коре тимуса, пройти приверженность T линии и стать Т-клеток предшественников 1. В коре, Т-клеток-предшественников CD4 и CD8 Double Negative (DN) тимоциты расширить и дифференцировать в незрелых CD4 и CD8 двойной положительный (DP) тимоцитов, образуя большой пул предшественников с сильно варьирует Т клеточных рецепторов 1. Только выберите MHC-ограничено подмножество DP клеток станет CD4 или CD8 сингл положительные (SP) тимоциты, мигрируют в костный мозг тимуса, и дифференцируются в функционально компетентных зрелых Т-клеток, мероприятие, известное, как позитивной селекции 2- 6. В отличие от этого, клоны аутореактивных тимоцитов пройти негативный отбор и удаляются с помощью апоптоза, преобразуется в регуляторных Т-клеток для аутотолерантности, или направлены в внутриэпителиальных лимфоцитов в целях, которые еще не ясно, 3,7-10.
В тимусе, тимуса стромальных клеток образуют уникальный микросреду, обеспечивающую сигналы для этих различных судеб развития клеток Т 5,11,12. Стромальные клетки тимуса состоят из эпителиальных клеток тимуса (ТИК) – в том числе коры головного мозга (ТЭМ) и cTECs сердцевинных ТЭМ (mTECs), дендритные клетки, макрофаги, фибробласты, эндотелиальные клетки нервного гребня, полученных перицитов и других мезенхимальных клеток 13-15. Среди них, ТИК имеют решающее значение на разных этапах T развития клеток 1,2,16,17. Тем не менее, отсутствие надежной образом, чтобы изолировать ТИК препятствует полное понимание своих функций 16. В частности, cTECs, которые образуют трехмерную сетку, окружающую клетки-предшественники в коре головного мозга, имеют важное значение для позитивной селекции 13,18,19 по причинам, которые еще не ясна. Более ранние исследования условии поможет понять, неоднородности и роли ТИК, в основном опираясь на морфологических и гистологических инструментов 13 </suр>. Недавно уникальные роли ТИК подмножеств обратились генетических подходов в мышиных моделях 12,20. Надежным и воспроизводимым способом изолировать ТИК является основополагающим для достижения объективную характеристику ТИК подмножеств, количественной и качественной оценки функций избирательных комиссий, и разъяснение механизмов, как cTECs поддерживает положительный выбор.
В связи с редкостью ТИК в тимусе и плотных взаимодействий они образуют в неповрежденной органа, изоляция ТИК был сложным. Протокол, описанный здесь, основаны на предыдущих открытий, имеющихся в настоящее время реагентов, методов и знания о структуре тимуса и стромы состава. Почти два десятилетия назад, было зарегистрировано несколько процедур разбить тимуса ткани 21-27, на которых были использованы различные ферменты в процессе пищеварения, в том числе трипсина, коллагеназы и диспаза. Серый и др. сравнил эти ферменты в их precedure 28, и сообщали об улучшении метамфетаминод с многошаговое переваривания ферментов коктейлей 29, которые стали широко использоваться 20,30. Тем не менее, этот метод включает в себя много времени на подготовку и сложные шаги пищеварения и приводит к переменной окончательное количество и долю ТИК клеток даже в том же мышиного когорты 29,30. Несколько лет назад, Liberase исследования сорт фермент, содержащий высокоочищенный коллагеназы и нейтральной протеазы начал использоваться в ткани вилочковой железы диссоциации 30. Здесь мы описываем Liberase пищеварение основе протокола, с оптимизированными процедурами механического разделения, который дает большое количество жизнеспособных ТИК от мыши тимуса тканей. .
Для обогащения диссоциированных стромальных клеток, предыдущие исследования использовались либо градиентов плотности или магнитной сепарации борта 21,29. Тем не менее, оба метода приводят к тяжелым потеряли некоторых популяций тимуса стромальных клеток, в частности населения cTECs 29. Цитотоксическая устранение и панорамирования методы <sдо> 31,32 были широко использованы для истощения или разделения лимфоцитов в иммунологической области 12,31. После сравнения этих методов, мы установили текущий протокол панорамирования для обогащения ТИК. Нежное состояние во время процедуры обогащения ведет к меньшему гибели клеток и беспристрастным и повышение уровня возмещения TEC.
Выделенный подвеска тимус клеток описано в разделе 3 могут быть непосредственно применены течь анализ цитометрический для идентификации и характеризации ТИК подмножеств и дендритных клеток. Раздел 4 описывает простой и удобный способ определения TEC подмножества, используя многопараметрическое проточного цитометра. Для экспериментов, которые стремятся получить очищенные cTECs или mTECs, обогащение TEC и сортировки клеток процедуры можно найти в разделе 5 и 6.
Protocol
Representative Results
Discussion
В протоколе, критические шаги являются подготовка тимуса стромальных клеток (раздел 3) и обогащение ТИК (раздел 4). Настоятельно рекомендуется, что свежий фермент раствор готовят каждый раз и ткань обрабатывают как можно скорее. Для объединенной Thymi, оптимизируя объем раствора фермента ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Работа выполнена при поддержке Национального института здравоохранения Грант R01 AI088209 (к KAH). Мы также благодарим Университет штата Миннесота проточной цитометрии ресурса.
Materials
| Anti-mouse EpCAM | eBioscience | XX-5791-YY* | Clone G8.8 |
| Anti-mouse MHC II | eBioscience | XX-5321-YY* | Clone M5/114.15.2 |
| Anti-mouse Ly51 | eBioscience | XX-5891-YY* | Clone 6C3 |
| UEA-1 | Vector Laboratory | FL-1061 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | LSRFortessa | |
| Flow cell sorter | BD Biosciences | FACSAria | |
| FACS tubes | BD Biosciences | 352052 | |
| Flow cytometry analysis software | TreeStar – Flowjo | FlowJo v7/9 | |
| *XX varies by fluorochrome and YY varies by vial size. |
References
- Rothenberg, E. V., Moore, J. E., Yui, M. A. Launching the T-cell-lineage developmental programme. Nat. Rev. Immunol. 8, 9-21 (2008).
- Anderson, G., Takahama, Y. Thymic epithelial cells: working class heroes for T cell development and repertoire selection. Trends Immunol. 33, 256-263 (2012).
- Klein, L., Hinterberger, M., Wirnsberger, G., Kyewski, B. Antigen presentation in the thymus for positive selection and central tolerance induction. Nat. Rev. Immunol. 9, 833-844 (2009).
- Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of T cells. Annu. Rev. Immunol. 21, 139-176 (2003).
- Takahama, Y., Takada, K., Murata, S., Tanaka, K. beta5t-containing thymoproteasome: specific expression in thymic cortical epithelial cells and role in positive selection of CD8. T cells. Curr. Opin. Immunol. 24, 92-98 (2012).
- Xing, Y., Wang, X., Igarashi, H., Kawamoto, H., Sakaguchi, N. Protein phosphatase subunit G5PR that regulates the JNK-mediated apoptosis signal is essential for the survival of CD4 and CD8 double-positive thymocytes. Mol. Immunol. 45, 2028-2037 (2008).
- Benoist, C., Mathis, D. Treg cells, life history, and diversity. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4, a007021 (2012).
- Pobezinsky, L. A., et al. Clonal deletion and the fate of autoreactive thymocytes that survive negative selection. Nat. Immunol. 13, 569-578 (2012).
- Stritesky, G. L., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Selection of self-reactive T cells in the thymus. Annu. Rev. Immunol. 30, 95-114 (2012).
- Xing, Y., Hogquist, K. A. T-cell tolerance: central and peripheral. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4, (2012).
- Anderson, G., Lane, P. J., Jenkinson, E. J. Generating intrathymic microenvironments to establish T-cell tolerance. Nat. Rev. Immunol. 7, 954-963 (2007).
- Xing, Y., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Thymoproteasome subunit-beta5T generates peptide-MHC complexes specialized for positive selection. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 6979-6984 (2013).
- Petrie, H. T., Zuniga-Pflucker, J. C. Zoned out: functional mapping of stromal signaling microenvironments in the thymus. Annu. Rev. Immunol. 25, 649-679 (2007).
- Rezzani, R., Bonomini, F., Rodella, L. F. Histochemical and molecular overview of the thymus as site for T-cells development. Prog. Histochem. Cytochem. 43, 73-120 (2008).
- Rodewald, H. R. Thymus organogenesis. Annu. Rev. Immunol. 26, 355-388 (2008).
- Griffith, A. V., et al. Spatial mapping of thymic stromal microenvironments reveals unique features influencing T lymphoid differentiation. Immunit. 31, 999-1009 (2009).
- Guerder, S., Viret, C., Luche, H., Ardouin, L., Malissen, B. Differential processing of self-antigens by subsets of thymic stromal cells. Curr. Opin. Immunol. 24, 99-104 (2012).
- Hogquist, K. A., Xing, Y. Why CD8+ T cells need diversity when growing up. Immunit. 32, 5-6 (2010).
- Jenkinson, E. J., Parnell, S., Shuttleworth, J., Owen, J. J., Anderson, G. Specialized ability of thymic epithelial cells to mediate positive selection does not require expression of the steroidogenic enzyme p450scc. J. Immunol. 163, 5781-5785 (1999).
- Murata, S., et al. Regulation of CD8+ T cell development by thymus-specific proteasomes. Science. 316, 1349-1353 (2007).
- Chidgey, A. P., Pircher, H., MacDonald, H. R., Boyd, R. L. An adult thymic stromal-cell suspension model for in vitro positive selection. Dev. Immunol. 6, 157-170 (1998).
- Izon, D. J., Nieland, J. D., Godfrey, D. I., Boyd, R. L., Kruisbeek, A. M. Flow cytometric analysis reveals unexpected shared antigens between histologically defined populations of thymic stromal cells. Int. Immunol. 6, 31-39 (1994).
- Jenkinson, E. J., Anderson, G., Owen, J. J. Studies on T cell maturation on defined thymic stromal cell populations in vitro. J. Exp. Med. 176, 845-853 (1992).
- Klein, L., Klugmann, M., Nave, K. A., Tuohy, V. K., Kyewski, B. Shaping of the autoreactive T-cell repertoire by a splice variant of self protein expressed in thymic epithelial cells. Nat. Med. 6, 56-61 (2000).
- Shortman, K., Vremec, D., D’Amico, A., Battye, F., Boyd, R. Nature of the thymocytes associated with dendritic cells and macrophages in thymic rosettes. Cell. Immunol. 119, 85-100 (1989).
- Volkmann, A., Zal, T., Stockinger, B. Antigen-presenting cells in the thymus that can negatively select MHC class II-restricted T cells recognizing a circulating self antigen. J. Immunol. 158, 693-706 (1997).
- Yang, S. J., Ahn, S., Park, C. S., Choi, S., Kim, M. G. Identifying subpopulations of thymic epithelial cells by flow cytometry using a new specific thymic epithelial marker, Ly110. J. Immunol. Method. 297, 265-270 (2005).
- Gray, D. H., Chidgey, A. P., Boyd, R. L. Analysis of thymic stromal cell populations using flow cytometry. J. Immunol. Method. 260, 15-28 (2002).
- Gray, D. H., et al. Unbiased analysis, enrichment and purification of thymic stromal cells. J. Immunol. Method. 329, 56-66 (2008).
- Williams, K. M., et al. Single cell analysis of complex thymus stromal cell populations: rapid thymic epithelia preparation characterizes radiation injury. Clin. Transl. Sci. 2, 279-285 (2009).
- Kanof, M. E. Purification of T cell subpopulations. Curr. Protoc. Immunol. 7 (Unit 7.3), (2001).
- Mage, M. G. Fractionation of T cells and B cells using panning techniques. Curr. Protoc. Immunol. 3 (Unit 3.5), (1991).
- Wekerle, H., Ketelsen, U. P., Ernst, M. Thymic nurse cells. Lymphoepithelial cell complexes in murine thymuses: morphological and serological characterization. The Journal of experimental medicin. 151, 925-944 (1980).
- Kyewski, B. A., Kaplan, H. S. Lymphoepithelial interactions in the mouse thymus: phenotypic and kinetic studies on thymic nurse cells. J Immuno. 128, 2287-2294 (1982).
- Nakagawa, Y., et al. Thymic nurse cells provide microenvironment for secondary T cell receptor alpha rearrangement in cortical thymocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 20572-20577 (2012).
- McLelland, B. T., Gravano, D., Castillo, J., Montoy, S., Manilay, J. O. Enhanced isolation of adult thymic epithelial cell subsets for multiparameter flow cytometry and gene expression analysis. J. Immunol. Method. 367, 85-94 (2011).
- Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium. Journal of immunological method. 385, 23-34 (2012).
