Isolement, identification et la purification de cellules murines thymique épithéliales

Au début du développement de cellules T, de la moelle osseuse souches hématopoïétiques progénitrices multipotentes dérivées de cellules sont recrutés dans le cortex du thymus, subir engagement à T lignée et de devenir des précurseurs de cellules T ^1. Dans le cortex, précurseurs des lymphocytes T CD4 et CD8 à double négatifs (DN) thymocytes se dilatent et se différencient en immatures CD4 et CD8 positif double (DP) thymocytes, la formation d'une grande piscine avec des progéniteurs très variable T récepteurs cellulaires ^1. Seul un sous-ensemble de sélection restreinte au CMH de cellules DP deviendra unique positifs (SP) thymocytes CD4 ou CD8, migrer vers la moelle du thymus, et se différencier en cellules T matures fonctionnellement compétentes, un événement qui est visé à la sélection positive ^{2 6.} En revanche, les clones de thymocytes auto-réactifs sont soumis à une sélection négative et sont évacués par l'apoptose, convertis en cellules T régulatrices pour l'auto-tolérance, ou dérivé de lymphocytes intra-épithéliaux à des fins qui ne sont pas encore clairement ^3,7-10.

Dans le thymus, les cellules stromales thymiques forment un microenvironnement unique, pour fournir des signaux destin ^5,11,12 ces différents de développement des cellules T. Les cellules stromales thymiques sont composés de cellules épithéliales thymiques (CET) – y compris TEC corticales (CTEC) et TEC médullaires (mTECs), les cellules dendritiques, les macrophages, les fibroblastes, les cellules endothéliales, les péricytes de la crête neurale et d'autres cellules mésenchymateuses ^13-15. Parmi ceux-ci, les TEC sont essentiels aux différents stades de développement des cellules T ^1,2,16,17. Cependant, l'absence d'un moyen efficace d'isoler TEC a entravé une compréhension globale de leurs fonctions ^16. En particulier, CTEC, qui forment un réseau tridimensionnel progéniteurs dans le cortex environnant, sont essentiels pour la sélection positive ^13,18,19 pour des raisons qui ne sont pas encore claires. Des études antérieures fournies indices quant à l'hétérogénéité et le rôle des TEC, la plupart s'appuyant sur ​​des outils morphologiques et histologiques ¹³ </sup>. Récemment, les rôles uniques de sous-ensembles TEC ont été abordés par des approches génétiques dans des modèles murins ^12,20. Une façon robuste et reproductible pour isoler TEC est fondamentale pour atteindre la caractérisation objective de sous-ensembles de TEC, une évaluation quantitative et qualitative des fonctions de TEC, et la clarification des mécanismes comment CTEC soutenir la sélection positive.

En raison de la rareté des TEC dans le thymus et les interactions serrés qu'ils forment dans l'organe intact, l'isolement des TEC a été difficile. Le protocole décrit ici est basé sur les découvertes précédentes, actuellement réactifs disponibles, les techniques et les connaissances de la structure du thymus et de la composition du stroma. Il ya près de deux décennies, plusieurs procédures ont été signalés à désagréger les tissus du thymus ^21-27, dans lequel les différentes enzymes ont été utilisés lors de la digestion, y compris la trypsine, la collagénase et Dispase. Gray et al. rapport ces enzymes dans leur precedure ^28, et fait état ​​d'une amélioration de la méthamphétamineod, avec une digestion multi-étape de cocktails d'enzymes ²⁹ qui sont devenus largement utilisé ^20,30. Cependant, cette méthode implique un temps de préparation longs et complexes étapes de digestion et entraîne dernière variable du nombre de cellules et les proportions des TEC, même dans la même cohorte de souris ^29,30. Il ya plusieurs années, Libérase enzyme de qualité de la recherche, hautement purifié contenant la collagénase et la protéase neutre commencé à être utilisé dans le tissu du thymus dissociation ^30. Ici, nous décrivons un protocole à base de Libérase digestion, avec des procédés de séparation mécanique optimisés, qui donne un grand nombre de dispositifs de refroidissement thermoélectriques viables à partir de tissus de thymus de souris. .

Pour enrichir les cellules stromales dissociés, des études antérieures ont utilisé soit des gradients de densité ou séparation magnétique de perles ^21,29. Cependant, les deux méthodes provoquent de graves perdu de certaines populations de cellules stromales thymiques, en particulier la population de CTEC ^29. Élimination cytotoxique et techniques panoramique <sjusqu'à> 31,32 ont largement été utilisés pour l'épuisement ou la séparation des lymphocytes dans le domaine immunologique ^12,31. Après comparaison de ces techniques, nous avons établi le protocole de panoramique actuel pour l'enrichissement des TEC. La condition douce au cours de la procédure d'enrichissement conduit à moins de la mort cellulaire et impartiale et une récupération accrue de TEC.

La suspension de cellules de thymus isolé décrit dans la section 3 peut être directement appliquée à l'analyse par cytométrie de débit pour l'identification et la caractérisation des sous-populations de cellules dendritiques et TEC. La section 4 décrit une méthode simple et utile pour identifier des sous-TEC à l'aide de flux multiparamétrique cytomètre. Pour les expériences qui cherchent à obtenir CTEC purifiés ou mTECs, l'enrichissement de TEC et procédures de tri cellulaire peut être trouvé dans la section 5 et 6.