İzolasyon, tanımlama ve Murin Thymic Epitel Hücreleri saflaştırılması
Summary
Burada izolasyonu, tanımlanması ve fare timik epitelial hücreler üzerinde (Tecs) saflaştırılması için etkili bir yöntem tarif eder. Bu protokol, normal T-hücresi gelişimi, timus disfonksiyon ve T hücresi sulandırılacak timus fonksiyonunun çalışmaları için kullanılabilir.
Abstract
Timus T-lenfosit gelişimi için hayati bir organdır. T hücre bağlılık, pozitif ve negatif seçim seçimi: timik stromal hücrelerin, timik epitel hücreleri (Tecs) T hücre gelişiminin çeşitli aşamalarında özellikle önemlidir. Bununla birlikte, timus Tecs işlevi tam olarak anlaşılamamıştır. Makalede, mekanik parçalama ve enzimatik sindirme bir kombinasyonu kullanılarak taze fare timusundan TEC alt kümelerini izole etmek için bir yöntem sağlar. Yöntem, timus hücreleri ve antikor fragmanlarının verimli hücre-hücre ve hücre-hücre dışı matris bağlantıları serbest kalmasına ve tek bir hücre süspansiyonu meydana getirmek üzere sağlar. Izole edilmiş hücreler kullanılarak, çok parametreli akış sitometri Tecs ve dendritik hücrelerin belirlenmesi ve karakterize edilmesi uygulanabilir. Tecs timus nadir hücre topluluğu olduğundan, daha da zenginleştirmek ve timositleri, timus içinde en bol hücre tipi tüketerek Tecs arındırmak için etkili bir yol tarif eder. Follohücre canlılığı kaybının Tecs saflaştırılması sırasında minimize edilebilir, böylece kanat zenginleştirme, hücre tasnifi, ayırma süresi azaltılabilir. Saflaştırılmış hücreleri Real Time PCR, Western blot ve gen ekspresyonu profillemesi gibi çeşitli alt analizler için uygundur. Protokol TEC fonksiyonun araştırma ve hem de in vitro T hücresi sulandırma gelişimini teşvik edecektir.
Introduction
Erken T hücresi gelişiminde, kemik iliği hematopoetik kök hücre türevli multipotent progenitorlar timus korteks için işe, T kökene bağlı geçmesi ve T hücresi ön-1 olur. Son derece değişken T hücre reseptörleri 1 progenitörlerin büyük bir havuz oluşturan, kortekste T hücresi öncü CD4 ve CD8 çift negatif (DN), timositler genişletmek ve olgun CD4 ve CD8 çift pozitif (DP), timositler içinde farklılık gösterir. Sadece DP hücrelerin seçilmiş bir MHC ile sınırlandırılmış bir alt kümesi, CD4 veya CD8 tek bir pozitif (SP), timositler hale timus medullaya geçer ve fonksiyonel olarak yetkin olgun T hücrelerine gibi pozitif seleksiyona 2 adlandırılan bir olay ayırt edecektir 6. Buna karşılık, oto-reaktif timositlerin klonları negatif seçim geçmesi ve öz-hoşgörü için düzenleyici T hücreleri dönüştürülür, ya da henüz net değil amaçlarla intraepitelyal lenfositlerin yönlendirilir, apoptoz yoluyla uzaklaştırılır 3,710.
Timus, timik stromal hücreler bu çeşitli T hücre gelişimi kaderi 5,11,12 için sinyalleri veren eşsiz bir mikroortam oluştururlar. Kortikal Tecs (cTECs) ve kemik iliği Tecs (mTECs), dendritik hücreler, makrofajlar, fibroblastlar, endotel hücreleri, nöral tepe türetilmiş perisitlerin ve mezenkimal hücreler de dahil olmak üzere 13-15 – Timus, stromal hücreleri, timik epitelial hücreler üzerinde (Tecs) oluşmaktadır. Bunlar arasında, Tecs T hücresi gelişme 1,2,16,17 çeşitli aşamalarında çok önemlidir. Ancak, Tecs izole etmek için sağlam bir yol olmaması işlevleri 16 kapsamlı bir anlayış engelliyordu. Özellikle, kortekste ata hücreleri çevreleyen, üç boyutlu bir ağ oluşturmak cTECs, henüz net değildir nedenlerle pozitif seçim 13,18,19 için gereklidir. Daha önceki çalışmalar çoğunlukla morfolojik ve histolojik araçları 13 güvenerek, Tecs heterojen ve rolü gibi ipuçları sağlanan </sus>. Son zamanlarda TEC alt kümelerinin eşsiz rolleri fare modellerinde 12,20 genetik yaklaşımlar ele alındı. Tecs izole etmek sağlam ve tekrarlanabilir yoldur cTECs pozitif seçim nasıl desteklediğini TEC alt kümeleri, TEC fonksiyonların nicel ve nitel değerlendirilmesi ve mekanizmaların aydınlatılmasını tarafsız karakterizasyonu elde esastır.
Nedeniyle onlar bozulmamış organ formu timus Tecs azlığı ve sıkı etkileşimler, Tecs izolasyonu zorlu olmuştur. Burada açıklanan protokol, önceki keşifler, mevcut reaktif, teknikleri, ve timus yapısı ve stromal kompozisyon bilgisine dayanmaktadır. Yaklaşık iki yıl önce, birkaç prosedür tripsin, Kollajenazının ve Dispase dahil olmak üzere farklı enzimler sindirimi sırasında kullanılan edildiği timus dokuları 21-27, parçalamak bildirildi. Gray ve ark. kendi Muhakemelerine 28 bu enzimler göre ve geliştirilmiş bir meth Başkaoldu enzim kokteyller 29 bir çoklu-aşamalı sindirim od yaygın 20,30 kullanılmaktadır. Ancak, bu yöntem uzun bir işlem süresi ve hatta aynı sıçangil kohort 29,30 hücre sayıları ve Tecs oranlar son değişken karmaşık sindirim adımlar ve sonuçları içerir. Birkaç yıl önce, Liberase® araştırma sınıfı enzim, son derece saf hale getirilir ve kolajenaz nötr proteaz timus doku ayrışma 30 kullanılmaya başlanmıştır içeren. Burada, fare timusundan dokulardan uygulanabilir Tecs yüksek numarasını verir iyileştirilmiş mekanik ayırma prosedürleri ile sindirim Liberase® tabanlı bir protokol tanımlıyoruz. .
Ayrışmış stromal hücreler zenginleştirmek için, daha önceki çalışmalar yoğunluk geçişlerini veya manyetik boncuk ayırma 21,29 ya kullandık. Ancak yöntem hem timik stromal hücreleri, cTECs 29 özellikle nüfusun belli popülasyonlarının kaybetti ciddi neden olur. Sitotoksik eliminasyon ve kaydırma teknikleri <s> 31,32 kadar yaygın immünolojik alanında 12,31 tüketilmesi veya lenfositlerin artan ayrılması için kullanılmıştır. Bu tekniklerin karşılaştırılması sonra, biz Tecs zenginleştirilmesi için geçerli kaydırma protokolünü kurulmuştur. Zenginleştirme işlemi sırasında nazik durum daha az hücre ölümü ve tarafsız ve artan TEC kurtarma yol açar.
Bölüm 3'te tarif edildiği gibi izole edilmiş bir hücre süspansiyonu, timus, doğrudan alt-TEC ve dendritik hücrelerin tanımlanması ve karakterizasyonu için akış sitometrik analizi, uygulanabilir. Bölüm 4 sitometresini multiparametre akışını kullanarak TEC alt kümelerini tanımlamak için basit ve kullanışlı bir yol. Saflaştırılmış cTECs veya mTECs, TEC zenginleştirme ve ayıklama prosedürleri hücresi elde etmeye deneyler için Bölüm 5 ve 6'da bulunabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokolde, kritik adımlar timus stromal hücrelerinin (Bölüm 3) hazırlama ve Tecs zenginleştirme (Bölüm 4) vardır. Kuvvetle taze enzim solüsyonu her zaman hazırlanır ve doku kısa sürede tedavi tavsiye edilir. Toplanmış Thymi için, enzim çözeltisinin hacmini optimize Thymi sayısına bağlı olarak gereklidir. Artık madde, herhangi bir doku, işlemden sonra kalan, daha fazla enzim çözeltisi ve inkübasyon süresi uzantısı ekleyerek hücre verimini artırabilir. Tecs zenginleştirilmesi, süpernata…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma (Kah için) Sağlık Hibe R01 AI088209 Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir. Biz de Minnesota Sitometrisi Kaynağın Üniversitesi teşekkür ederim.
Materials
| Anti-mouse EpCAM | eBioscience | XX-5791-YY* | Clone G8.8 |
| Anti-mouse MHC II | eBioscience | XX-5321-YY* | Clone M5/114.15.2 |
| Anti-mouse Ly51 | eBioscience | XX-5891-YY* | Clone 6C3 |
| UEA-1 | Vector Laboratory | FL-1061 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | LSRFortessa | |
| Flow cell sorter | BD Biosciences | FACSAria | |
| FACS tubes | BD Biosciences | 352052 | |
| Flow cytometry analysis software | TreeStar – Flowjo | FlowJo v7/9 | |
| *XX varies by fluorochrome and YY varies by vial size. |
References
- Rothenberg, E. V., Moore, J. E., Yui, M. A. Launching the T-cell-lineage developmental programme. Nat. Rev. Immunol. 8, 9-21 (2008).
- Anderson, G., Takahama, Y. Thymic epithelial cells: working class heroes for T cell development and repertoire selection. Trends Immunol. 33, 256-263 (2012).
- Klein, L., Hinterberger, M., Wirnsberger, G., Kyewski, B. Antigen presentation in the thymus for positive selection and central tolerance induction. Nat. Rev. Immunol. 9, 833-844 (2009).
- Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of T cells. Annu. Rev. Immunol. 21, 139-176 (2003).
- Takahama, Y., Takada, K., Murata, S., Tanaka, K. beta5t-containing thymoproteasome: specific expression in thymic cortical epithelial cells and role in positive selection of CD8. T cells. Curr. Opin. Immunol. 24, 92-98 (2012).
- Xing, Y., Wang, X., Igarashi, H., Kawamoto, H., Sakaguchi, N. Protein phosphatase subunit G5PR that regulates the JNK-mediated apoptosis signal is essential for the survival of CD4 and CD8 double-positive thymocytes. Mol. Immunol. 45, 2028-2037 (2008).
- Benoist, C., Mathis, D. Treg cells, life history, and diversity. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4, a007021 (2012).
- Pobezinsky, L. A., et al. Clonal deletion and the fate of autoreactive thymocytes that survive negative selection. Nat. Immunol. 13, 569-578 (2012).
- Stritesky, G. L., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Selection of self-reactive T cells in the thymus. Annu. Rev. Immunol. 30, 95-114 (2012).
- Xing, Y., Hogquist, K. A. T-cell tolerance: central and peripheral. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4, (2012).
- Anderson, G., Lane, P. J., Jenkinson, E. J. Generating intrathymic microenvironments to establish T-cell tolerance. Nat. Rev. Immunol. 7, 954-963 (2007).
- Xing, Y., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Thymoproteasome subunit-beta5T generates peptide-MHC complexes specialized for positive selection. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 6979-6984 (2013).
- Petrie, H. T., Zuniga-Pflucker, J. C. Zoned out: functional mapping of stromal signaling microenvironments in the thymus. Annu. Rev. Immunol. 25, 649-679 (2007).
- Rezzani, R., Bonomini, F., Rodella, L. F. Histochemical and molecular overview of the thymus as site for T-cells development. Prog. Histochem. Cytochem. 43, 73-120 (2008).
- Rodewald, H. R. Thymus organogenesis. Annu. Rev. Immunol. 26, 355-388 (2008).
- Griffith, A. V., et al. Spatial mapping of thymic stromal microenvironments reveals unique features influencing T lymphoid differentiation. Immunit. 31, 999-1009 (2009).
- Guerder, S., Viret, C., Luche, H., Ardouin, L., Malissen, B. Differential processing of self-antigens by subsets of thymic stromal cells. Curr. Opin. Immunol. 24, 99-104 (2012).
- Hogquist, K. A., Xing, Y. Why CD8+ T cells need diversity when growing up. Immunit. 32, 5-6 (2010).
- Jenkinson, E. J., Parnell, S., Shuttleworth, J., Owen, J. J., Anderson, G. Specialized ability of thymic epithelial cells to mediate positive selection does not require expression of the steroidogenic enzyme p450scc. J. Immunol. 163, 5781-5785 (1999).
- Murata, S., et al. Regulation of CD8+ T cell development by thymus-specific proteasomes. Science. 316, 1349-1353 (2007).
- Chidgey, A. P., Pircher, H., MacDonald, H. R., Boyd, R. L. An adult thymic stromal-cell suspension model for in vitro positive selection. Dev. Immunol. 6, 157-170 (1998).
- Izon, D. J., Nieland, J. D., Godfrey, D. I., Boyd, R. L., Kruisbeek, A. M. Flow cytometric analysis reveals unexpected shared antigens between histologically defined populations of thymic stromal cells. Int. Immunol. 6, 31-39 (1994).
- Jenkinson, E. J., Anderson, G., Owen, J. J. Studies on T cell maturation on defined thymic stromal cell populations in vitro. J. Exp. Med. 176, 845-853 (1992).
- Klein, L., Klugmann, M., Nave, K. A., Tuohy, V. K., Kyewski, B. Shaping of the autoreactive T-cell repertoire by a splice variant of self protein expressed in thymic epithelial cells. Nat. Med. 6, 56-61 (2000).
- Shortman, K., Vremec, D., D’Amico, A., Battye, F., Boyd, R. Nature of the thymocytes associated with dendritic cells and macrophages in thymic rosettes. Cell. Immunol. 119, 85-100 (1989).
- Volkmann, A., Zal, T., Stockinger, B. Antigen-presenting cells in the thymus that can negatively select MHC class II-restricted T cells recognizing a circulating self antigen. J. Immunol. 158, 693-706 (1997).
- Yang, S. J., Ahn, S., Park, C. S., Choi, S., Kim, M. G. Identifying subpopulations of thymic epithelial cells by flow cytometry using a new specific thymic epithelial marker, Ly110. J. Immunol. Method. 297, 265-270 (2005).
- Gray, D. H., Chidgey, A. P., Boyd, R. L. Analysis of thymic stromal cell populations using flow cytometry. J. Immunol. Method. 260, 15-28 (2002).
- Gray, D. H., et al. Unbiased analysis, enrichment and purification of thymic stromal cells. J. Immunol. Method. 329, 56-66 (2008).
- Williams, K. M., et al. Single cell analysis of complex thymus stromal cell populations: rapid thymic epithelia preparation characterizes radiation injury. Clin. Transl. Sci. 2, 279-285 (2009).
- Kanof, M. E. Purification of T cell subpopulations. Curr. Protoc. Immunol. 7 (Unit 7.3), (2001).
- Mage, M. G. Fractionation of T cells and B cells using panning techniques. Curr. Protoc. Immunol. 3 (Unit 3.5), (1991).
- Wekerle, H., Ketelsen, U. P., Ernst, M. Thymic nurse cells. Lymphoepithelial cell complexes in murine thymuses: morphological and serological characterization. The Journal of experimental medicin. 151, 925-944 (1980).
- Kyewski, B. A., Kaplan, H. S. Lymphoepithelial interactions in the mouse thymus: phenotypic and kinetic studies on thymic nurse cells. J Immuno. 128, 2287-2294 (1982).
- Nakagawa, Y., et al. Thymic nurse cells provide microenvironment for secondary T cell receptor alpha rearrangement in cortical thymocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 20572-20577 (2012).
- McLelland, B. T., Gravano, D., Castillo, J., Montoy, S., Manilay, J. O. Enhanced isolation of adult thymic epithelial cell subsets for multiparameter flow cytometry and gene expression analysis. J. Immunol. Method. 367, 85-94 (2011).
- Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium. Journal of immunological method. 385, 23-34 (2012).
