Modeling Astrocytoom Pathogenese<em> In Vitro</em> En<em> In Vivo</em> Met behulp van corticale Astrocyten of neurale stamcellen uit Conditional, genetisch gemanipuleerde muizen

Astrocytomen zijn de meest voorkomende primaire hersentumor en glioblastoma (GBM), een graad IV astrocytoom, is de meest voorkomende en agressieve subtype met een mediane overleving van 12-15 maanden ^1,2. Invasie van diffuse astrocytomen, vooral GBM, verzet zich tegen volledige chirurgische resectie, beperkt de effectiviteit van adjuvante therapie, en leidt onvermijdelijk tot na de behandeling herhaling ^3. Patiënten die aanvankelijk aanwezig, hetzij met de novo (primaire) GBM of met lagere rang astrocytomas die onvermijdelijk vordert naar (secundaire) GBM ^4. GBM is genomisch heterogeen en gekenmerkt door elkaar uit en co-voorkomende mutaties in genen die drie belangrijke signaalwegen geregeld: de _G1 / S (Rb) celcyclus, receptor tyrosine kinase (RTK) en TP53 pathways ^5-7. GBM bestaat uit vier genomische subtypen met verschillende expressie profielen die verschillende hersengebieden celtypes lijken, wat suggereert dat de GBM subtype is Inflube- stuurders door de cel van oorsprong ^6,8,9. Betere astrocytoma modellen moeten de rol van specifieke combinaties van mutaties in bepaalde celtypen tijdens astrocytoom pathogenese definiëren. Gebruikmakend van deze modellen voor efficiëntere preklinische ontwikkeling van geneesmiddelen zal uiteindelijk helpen bij het verbeteren van patient outcomes. Huidige astrocytoom modellen zijn zowel gevestigde menselijke cellijnen, patiënt afgeleid xenograften (PDX), genetisch gemodificeerd normale menselijke astrocyten en neurale stamcellen (NSC), en genetisch gemanipuleerde muizen (GEM) ^10-14. Ontwikkelden we een alternatieve, niet-kiembaan GEM (nGEM) model ¹⁵ met behulp van primaire hersencellen – corticale astrocyten en NSC – geoogst van GEM herbergen verschillende combinaties van floxed oncogene allelen. Het doel was om astrocytoma modellen met genetische gedefinieerde cellen die fenotypisch kan worden gekarakteriseerd in vitro en in vivo en mogelijk gebruikt voor preklinische ontwikkeling van geneesmiddelen in i genererenmmune-competente muizen.

Gevestigde humane cellijnen zijn de meest gebruikte model van astrocytoma pathogenese en drugs respons in vitro en in vivo. Zijn technisch eenvoudig, algemeen beschikbaar en zijn kinetiek en tumorigeniciteit bij orthotope xenografting gedefinieerd in immunodeficiënte muizen ^10,11,16-18 . Hun nadelen zijn het onvermogen om gevestigde cellijnen van low-grade astrocytomen genereren, studie alleen om high-grade astrocytomen beperken; ontbreken van een bepaald cel van oorsprong; de aanwezigheid van complexe genomische afwijkingen, vaak genomic profielen die sterk afwijken van het oorspronkelijke bloedmonster; en gevoeligheid voor fenotypische en genotypische drift tijdens seriële cultuur in serum ^11,17,19-22. De fenotypische gevolgen van individuele oncogene mutaties in bestaande humane GBM cellijnen kunnen worden gemaskeerd door de veelheid van afwijkingen die daadwerkelijk aanwezig zijn, die vaak uitsluit elucidation rechtstreeks genotype-fenotype gevolgen.

PDX worden opgewekt door subcutane passage van patiënt geïsoleerd astrocytoom cellen in immunodeficiënte muizen of door hun cultuur als niet-hechtende sferoïden in gedefinieerd serumvrij medium voordat orthotope injectie in de hersenen van immunodeficiënte muizen ^12,23. PDX nauwkeuriger handhaven de genomische landschap van menselijke astrocytoma, maar vergelijkbaar met gevestigde humane cellijnen, kan het fenotypisch effect van afzonderlijke oncogene mutaties worden gemaskeerd door hun genomische complexiteit ^19,24. De fenotypische gevolgen van specifieke oncogene mutaties definiëren, met name in reactie op nieuwe therapieën, zijn platen van gevestigde humane cellijnen of PDX vaak gebruikt om genotype-fenotype correlaties tonen generaliseerbaarheid en de kans cellijn-specifieke effecten te minimaliseren. Terwijl PDX nauwkeurig recapituleren de histopathologische kenmerken van de menselijke astrocytomas, incLuding invasie, orthotopische xenograften van gevestigde menselijke cellijnen algemeen niet ^21,23,25. Bovendien normale humane astrocyten en NSC zijn genetisch gemanipuleerd met gedefinieerde oncogene mutaties model astrocytoma tumorigenese in vitro en in vivo ^13,14,26. Deze cellen missen het genomische complexiteit van gevestigde humane cellijnen en PDX en nauwkeurig herhalen menselijke astrocytoma histopathologie, maar vereisen xenografting in immunodeficiënte knaagdieren in vivo. Omdat alle menselijke celmodellen nodig immunodeficiënte knaagdiergastheren immuungemedieerde xenograft afstoting te voorkomen, deze modellen niet de natieve tumor-stroma interacties van een syngene systeem recapituleren en missen een intact immuunsysteem, beperken preklinische onderzoek-stroma gerichte en immuun-modulerende therapieën ^10,11.

GEM vergunning onderzoek van de fenotypische gevolgen van voorafbepaalde combinaties van oncogene mutaties in vivo tijdens in situ het ontstaan ​​van tumoren. Terwijl niet-conditionele GEM hebben mutaties in alle weefsels tijdens de ontwikkeling, kennen voorwaardelijke GEM oncogene allelen waarmee targeting van mutaties door het beperken Cre gemedieerde recombinatie specifieke celtypen door gebruik van celtype-specifieke promoters ^10,11,15,18 floxed. Voorwaardelijke astrocytoma GEM zijn gebruikt om de functionele rol van oncogene mutaties in verschillende celtypes ophelderen binnen een intacte hersenen ^11. De preklinische nut van in situ gliomagenesis die voorwaardelijke GEM wordt beperkt door een aantal factoren, waaronder 1) het ontbreken van een in vitro correlaat, 2) moeilijkheden bij het ​​genereren van grote cohorten van muizen met complexe genotypes, 3) lange latentie van in situ tumorontwikkeling , 4) en stochastische tumorprogressie. Omdat in situ tumorigenese mist een overeenkomstige in vitro model, drug testen in vitro kan worden uitgevoerd with conventionele voorwaardelijke GEM modellen. In tegenstelling tot andere kankers zijn voorwaardelijke GEM modellen van astrocytomen zelden geïnduceerd door enkele oncogene mutaties ^11. Zo worden complexe fokprogramma's nodig om voorwaardelijke GEM met meerdere oncogene mutaties te genereren. Bovendien astrocytoma initiatie optreedt met variabele penetrantie na een lange latentieperiode in deze modellen, terwijl progressie naar hooggradige astrocytomen treedt meestal in een niet-uniforme, stochastische wijze en uiteindelijk leidt tot tumoren met complexe genomische landschappen en snelle groei kinetiek ^{27, 28.} De variabele penetrantie en stochastische aard van kwaadaardige progressie in voorwaardelijke GEM modellen vereist dat individuele muizen worden gescreend door radiografische beeldvorming om de aanwezigheid en locatie van high-grade astrocytomen detecteren vóór hun inschrijving in preklinisch geneesmiddelenonderzoek. Tezamen bieden deze beperkingen belemmeren het genereren en testen van de grote cohorten van voorwaardelijke GEM nodig voor preClinical drugstests.

De RCAS-tva GEM-systeem, waarbij aviaire retrovirale (RCAS) vectoren gebruikt om GEM ontwikkeld om de virale receptor (tva) over specifieke neurale celtypes uiten infecteren, is uitgebreid gebruikt om het model astrocytoom tumorvorming ^11. In tegenstelling tot voorwaardelijke GEM, dit modelsysteem maakt introductie van meerdere oncogene mutaties in specifieke celtypen zonder de noodzaak voor complexe fokprogramma's. Wordt echter beperkt door variabele penetrantie het vereiste van actief delende cellen virale integratie en de willekeurige insertie van transgenen in het gastheergenoom ^29.

Non-kiemlijn GEM (nGEM) modellen die cellen geoogst GEM gebruiken, wordt steeds belangrijker omdat overwinnen veel van de beperkingen van andere modelsystemen ^15. De rol initiëren celtype en co-voorkomende mutaties in astrocytoma pathogenese moeilijk te ontmoedigenmijne met behulp van bestaande humane GBM cellijnen of PDX omdat ze zijn afgeleid van het eindstadium van tumoren die uitgebreide genetische mutaties in undefined celtypen hebben opgebouwd in de loop van kwaadaardige progressie. Daarentegen kunnen alle soorten astrocytomen worden gemodelleerd met nGEM door het induceren gedefinieerde genetische mutaties binnen bepaalde gezuiverde hersenen celtypen ^11,30. Aldus kan de invloed van specifieke genetische mutaties en celtype over cellulaire en moleculaire fenotypes worden bepaald in vitro en in vivo. Vergelijkbaar met bestaande humane GBM cellijnen, kan in eerste instantie in vitro drug testen met behulp nGEM worden gebruikt om drugs voor in vivo onderzoek met behulp van dezelfde cellen te prioriteren. Tumorigenese in vivo kan dan worden bepaald door allografting nGEM orthotopically cellen in de hersenen van immuuncompetente syngene nestgenoten ^30. Deze orthotopische allogreffe modellen toestaan ​​daarom in vivo testen, niet alleen van conventionele cytotoxische eennd gerichte therapieën, maar immuun-modulerende en stroma-gerichte therapieën ook. Tenslotte kan de rol van het micromilieu op tumor initiatie en progressie worden bepaald door vergelijking van resultaten tussen nGEM en conventionele GEM modellen met dezelfde mutaties in dezelfde cel types.

Wij en anderen hebben astrocytoom nGEM ontwikkeld met behulp van primaire cellen – astrocyten, NSC, of oligodendrocyte voorloper cellen (OPC) – geoogst van GEM ^30-34. De reden voor de ontwikkeling van een astrocytoom nGEM was een model om de fenotypische gevolgen van oncogene mutaties in specifieke celtypen die zouden kunnen worden gebruikt voor preklinisch onderzoek drug in vitro en in vivo in immuuncompetente dieren vast te maken. We geoogst fenotypisch WT corticale astrocyten en NSC uit niet-Cre uiten voorwaardelijke GEM gehandhaafd op een> 94% C57 / Bl6 achtergrond met floxed RB pad – Rb1 ^{loxP / loxP} of TgGZT121 – en floxed RTK / RAS / PI3K – Nf1 ^{loxP / loxP,} Kras ^G12D, Pten ^{loxP / loxP} – genen in verschillende combinaties ^35-39. We geïnduceerde genetische recombinatie in vitro met adenovirale vectoren die coderen voor Cre recombinase. Omdat corticale astrocyten oogsten bevatten een mengsel van celtypen, gebruikten we Ad5GFAPCre vectoren of dominante oncogene transgenen, zoals TgGZT ₁₂₁ gedreven uit de menselijke GFAP promotor, te verrijken voor GFAP ⁺ corticale astrocyten in deze culturen. Wij hebben de fenotypische gevolgen van _G1 / S (Rb), MAPK en PI3K mutaties in corticale astrocyten en NSC in vitro en in vivo. MAPK en PI3K-route geactiveerd G1 / S-defecte astrocyten moleculair nagebootste menselijke proneural GBM en na orthotope injectie gevormde tumoren in een vooraf gedefinieerde locatie uniforme groeikinetiek korte latencies en de histopathologischeal kenmerken van de menselijke GBM ^30. Longitudinale monitoring van tumorgroei in vivo bevordert preklinische testen geneesmiddel door normalisering behandeling cohorten en kwantitatieve analyse van tumorgroei in respons op de behandeling ^40. We bepaald tumorgroei kinetiek door longitudinale bioluminescentie beeldvorming van muizen geïnjecteerd met luciferase uiten corticale astrocyten. Daarom corticale astrocyten en NSC afgeleid van voorwaardelijke GEM zorgen voor een soepel model systeem voor de bepaling van de functionele gevolgen van-astrocytoom-geassocieerde mutaties en een potentiële modelsysteem voor preklinische ontwikkeling van geneesmiddelen.