דוגמנות אסטרוציטומה פתוגנזה<em> במבחנה</em> ו<em> בVivo</em> שימוש בקליפת מוח האסטרוציטים או בתאי גזע עצביים מעכברים מותנים, מהונדסים גנטי

Astrocytomas הוא הגידול השכיח ביותר העיקרי המוח וגליובלסטומה (GBM), אסטרוציטומה IV כיתה, הוא תת הסוג הנפוץ ואגרסיווי ביותר עם ​​חציון הישרדות של 12-15 חודשים ^1,2. פלישה של astrocytomas המפוזר, במיוחד GBM, מונעת כריתה כירורגית מלאה, מגבילה את האפקטיביות של טיפולי אדג'ובנט, ומובילה בהכרח להישנות לאחר טיפול ^3. חולים בתחילה הווה או עם דה נובו GBM (העיקרי) או עם astrocytomas ציון נמוך שאופן בלתי נמנע מתקדם לGBM (המשני) ^4. GBM הוא genomically הטרוגניות ומאופיין במוטציות מוציאות ושיתוף המתרחש בגנים ששולטים בשלושה מסלולי ליבת איתות: מחסום מחזור תא G ₁ / S (Rb), טירוזין קינאז רצפטור (RTK), וTP53 מסלולי ^5-7. GBM מורכב מארבעה תת סוגים הגנומי עם פרופילי ביטוי שונים שדומים סוגי תאים שונים במוח, המצביע על כך תת סוג GBM הוא influמושפע מתאה של ^6,8,9 מוצא. מודלים אסטרוציטומה טובים יותר נדרשים כדי להגדיר את התפקיד של שילובים מסוימים של מוטציות בסוגים מסוימים של תאים בפתוגנזה אסטרוציטומה. מינוף מודלים אלה לפיתוח תרופה פרה קליני יעיל יותר סופו של דבר לעזור לשפר את תוצאות מטופל. מודלים אסטרוציטומה הנוכחיים כוללים הוקמו שורות תאים אנושיות, xenografts חולה נגזר (PDX), האסטרוציטים אדם נורמלים מהונדסים גנטי ותאי גזע עצביים (המל"ל), ועכברים מהונדסים גנטי (GEM) ^10-14. פיתחנו חלופי, GEM לא בתאי מין מודל (nGEM) ¹⁵ ניצול תאים ראשוניים במוח – קליפת המוח האסטרוציטים ומועצה לביטחון לאומית – שנקטפו מן GEM מחסה שילובים שונים של אללים שעור floxed. המטרה הייתה ליצור מודלים אסטרוציטומה עם תאים מוגדרים גנטי שיכולה להיות מאופיין phenotypically הן במבחנה in vivo ובאופן פוטנציאלי מנוצלים לפיתוח תרופות פרה קליני בiעכברי mmune-מוסמך.

שורות תאים אנושיות שהוקמו הן המודל הנפוץ ביותר של הפתוגנזה אסטרוציטומה ותגובת תרופה במבחנת in vivo. הם מבחינה טכנית ישר קדימה, זמינים באופן נרחב, והגדירו קינטיקה וtumorigenicity על xenografting orthotopic בעכברי immunodeficient ^10,11,16-18 . החסרונות שלהם כוללים את חוסר היכולת ליצור שורות תאים הוקמו מastrocytomas בדרגה נמוכה, הגבלת הלימוד רק לastrocytomas בדרגה גבוהה; חוסר תא מוגדר של מקור; הנוכחות של חריגות הגנומי מורכבות, לעתים קרובות עם פרופילים גנומיים הנבדלים במידה ניכרת ממדגם החולה המקורי; ורגישות לפנוטיפי ולהיסחף genotypic במהלך התרבות סידורי בסרום ^11,17,19-22. ההשלכות פנוטיפי של מוטציות סרטניות בודדות בשורות תאי GBM הוקמו אנושיות יכולות להיות רעול פנים על ידי המון פגמים שהם בעצם הווה, שלעתים קרובות הוא מונע elucidation של השלכות גנוטיפ פנוטיפ ישירות.

PDX נוצרים באמצעות מעבר תת עורית של תאי אסטרוציטומה מבודד מטופל בעכברי immunodeficient או דרך התרבות שלהם כspheroids שאינו חסיד שבהוגדר בינוני סרום ללא, לפני הזרקת orthotopic לתוך מוחם של עכברי immunodeficient ^12,23. PDX בצורה מדויקת יותר לשמור על הנוף הגנומי של astrocytomas האנושי, אבל דומה לשורות תאים אנושיות שהוקמו, ההשפעה פנוטיפי של מוטציות סרטניות בודדות יכולה להיות רעול פנים בשל המורכבות הגנומי שלהם ^19,24. כדי להגדיר את ההשלכות פנוטיפי של מוטציות סרטניות ספציפיות, במיוחד בתגובה לטיפולים חדשניים, פנלים של קווים הוקמו תא אנושיים או PDX לעתים קרובות מנוצלים כדי להקים מתאמי גנוטיפ, פנוטיפ, להראות יכולת הכללה, ולמזער את הסבירות להשפעות של קו ספציפי תא. בעוד PDX במדויק לשחזר את סימני ההיכר histopathological של astrocytomas האנושי, including פלישה, xenografts orthotopic של שורות תאים אנושיות שהוקמו בדרך כלל לא ^21,23,25. בנוסף, האסטרוציטים אדם נורמלים ומועצה לביטחון לאומית כבר מהונדסים גנטיים עם מוטציות סרטניות מוגדרות למודל יצירת גידולי אסטרוציטומה במבחנת in vivo ^13,14,26. תאים אלה חסרים את המורכבות הגנומי של קווים הוקמו תא אנושיים וPDX ובאופן מדויק לשחזר היסטופתולוגיה אסטרוציטומה אנושית, אך דורשים xenografting במכרסמים immunodeficient in vivo. מכיוון שכל דגמי התא האנושיים דורשים מארחי מכרסמים immunodeficient למניעת דחיית xenograft בתיווך חיסונית, דגמים אלה אינם לשחזר את אינטראקציות גידולי סטרומה יליד מערכת syngeneic וחסרי מערכת חיסונית שלמה, הגבלת חקירה פרה קלינית של חיסון modulatory הממוקד סטרומה ו טיפול בעזרת ^10,11.

בדיקת היתר GEM של ההשלכות פנוטיפי של שילובים קבועים מראש של muta שהעורמשא in vivo ביצירת גידולי אתר. והואיל ולGEM שאינו מותנה מוטציות בתוך כל הרקמות בפיתוח, GEM המותנה שfloxed אללים שעור המאפשרים מיקוד של מוטציות על ידי הגבלת רקומבינציה בתיווך Cre לסוגי תאים מסוימים באמצעות שימוש במקדמי הסוג ספציפי של תאי ^10,11,15,18. GEM אסטרוציטומה המותנה כבר נוצל כדי להבהיר את התפקידים הפונקציונליים של מוטציות סרטניות בסוגים שונים של תאים בתוך מוח שלם ^11. השירות פרה הקליני של בgliomagenesis אתר באמצעות GEM המותנה מוגבל על ידי מספר גורמים, כולל 1) חוסר לתאם במבחנה, 2) קושי ביצירת קבוצות גדולות של עכברים עם גנוטיפים מורכבים, 3) חביון ארוכה של בהתפתחות גידולים באתר , 4) וסטוכסטיים התקדמות גידול. כי באתרו יצירה גידולים חסר מודל מתאים במבחנה, בדיקות סמים במבחנה לא ניתן לבצע wמודלים ith קונבנציונליים מותנים GEM. בניגוד לסוגי סרטן אחר, מודלים GEM מותנים של astrocytomas מושרים לעתים רחוקות על ידי מוטציות סרטניות בודדות ^11. כך, תוכניות רבייה מורכבות נדרשות כדי ליצור GEM המותנה עם מוטציות שעור מרובות. יתר על כן, ייזום אסטרוציטומה מתרחש עם חדירות משתנים לאחר תקופת חביון ארוכה במודלים אלה, תוך התקדמות לastrocytomas בדרגה גבוהה בדרך כלל מתרחשת בלא אחידה, צורה אקראית וסופו של דבר מביאה לגידולים עם נופים הגנומי מורכבים וקינטיקה צמיחה מהירה ^{27, 28.} החדירות משתנים והטבע סטוכסטיים של התקדמות ממארת בדגמי GEM מותנים דורשים כי עכברים בודדים שיוקרנו על ידי הדמיה רדיוגרפית כדי לזהות את הנוכחות ומיקום של astrocytomas בדרגה גבוהה לפני גיוסם בניסויים פרה קליניים בסמים. יחדיו, מגבלות אלה לעכב את הדור ובדיקה של הקבוצות הגדולות של GEM המותנה הנדרש ליחסי ציבורבדיקות סמים eclinical.

מערכת GEM RCAS-רשות עמק טנסי, אשר מנצלת retroviral עופות וקטורים (RCAS) להדביק GEM שהונדס קולט הנגיפי (רשות עמק טנסי) על סוגי תאים עצביים ספציפיים, נוצלה בהרחבה למודל יצירת גידולי אסטרוציטומה ^11. בניגוד לGEM המותנה, מערכת מודל זה מאפשרת כניסתה של מוטציות סרטניות מרובות בסוגים ספציפיים תאים ללא דרישה לתוכניות רבייה מורכבות. עם זאת, הוא מוגבל על ידי חדירות משתנים, הדרישה לפעילה חלוקת תאים להשיג אינטגרציה נגיפית, וההחדרה האקראית של transgenes לתוך הגנום המארח ^29.

מודלים GEM (nGEM) ללא בתאים מין, אשר מנצלים תאים שנקטפו מGEM, הם הופכים חשובים יותר ויותר, כי הם להתגבר על רב מהמגבלות של מערכות מודל אחרות ^15. התפקיד של ייזום סוג תא ומוטציות שיתוף המתרחש בפתוגנזה אסטרוציטומה קשה להרתיעמכרה באמצעות הוקמה קווים אנושיים GBM תא או PDX כי הם נגזרים מגידולים בשלב סופי שהצטברו מוטציות גנטיות נרחבות בסוגים מוגדרים של תאים במהלך התפתחות ממארת. בניגוד לכך, כל הציונים של astrocytomas יכולים להיות מודל באמצעות nGEM ידי גרימה מוגדרת מוטציות גנטיות בתוך סוגי תאי המוח מטוהרים ספציפיים ^11,30. לפיכך, ההשפעה של מוטציות גנטיות ספציפיות וסוג תא בפנוטיפים תאיים ומולקולריים ניתן לקבוע במבחנת in vivo. בדומה לשורות תאי GBM הוקמו אנושיות, במבחנה בדיקות סמים ראשוניות באמצעות nGEM יכולות לשמש כדי לתעדף תרופות לבדיקות במבחנה תוך שימוש באותם התאים. יצירת גידולים in vivo אז יכול להיות שנקבעו על ידי allografting תאי nGEM orthotopically למוחן של המלטת syngeneic חיסון מוסמכת ^30. מודלים של שתל orthotopic אלה ולכן מאפשרים בבדיקת vivo לא רק של ציטוטוקסיות קונבנציונלייםnd ממוקד טיפולים, אבל חיסוני-modulatory וטיפולים ממוקדי סטרומה גם כן. לבסוף, תפקידה של microenvironment על התחלה של גידול והתקדמות יכול להיות נקבע על ידי השוואת תוצאות בין nGEM ודגמי GEM קונבנציונליים משתמשת באותו מוטציות באותו סוגי התאים.

אנו ואחרים פיתחו אסטרוציטומה nGEM באמצעות תאים ראשוניים – האסטרוציטים, המועצה לביטחון לאומי, או תאי אב oligodendrocyte (OPC) – שנקטפו מן GEM ^30-34. הרציונל מאחורי הפיתוח של אסטרוציטומה nGEM היה ליצור מודל כדי לקבוע את ההשלכות פנוטיפי של מוטציות סרטניות בסוגי תאים מסוימים שעלולים לשמש לבדיקות סמים פרה קליניות במבחנת in vivo בבעלי החיים חיסון מוסמך. אנו נקטפנו האסטרוציטים phenotypically WT קליפת המוח ומועצה לביטחון לאומי שמאינו Cre להביע, GEM המותנה לקיים מ94% רקע C57 / BL6> עם מסלול RB floxed – RB1 ^{loxP / loxP,} או TgGZT121 – וfloxed מסלול RTK / RAS / PI3K – NF1 ^{loxP / loxP,} קראס ^G12D, PTEN ^{loxP / loxP} – גנים בשילובים שונים ^35-39. אנו מושרה רקומבינציה הגנטית במבחנה באמצעות וקטורי adenoviral קידוד recombinase Cre. בגלל יבולי astrocyte קליפת המוח מכילים תערובת של סוגי תאים, השתמשנו וקטורי Ad5GFAPCre או transgenes שעור דומיננטי, כגון TgGZT ₁₂₁ מונעים מאמרגן GFAP האנושי, להעשיר לGFAP ⁺ האסטרוציטים בקליפת המוח בתרבויות אלה. אנחנו הגדרנו את ההשלכות פנוטיפי של G ₁ / S (Rb), MAPK, ומוטציות מסלול PI3K בהאסטרוציטים בקליפת המוח ומועצה לביטחון לאומית במבחנת in vivo. האסטרוציטים MAPK וG1-מופעל / PI3K S-פגום GBM מולקולרי חיקה אדם proneural ו, על הזרקת orthotopic, גידולים שנוצרו במיקום מוגדר מראש עם קינטיקה צמיחה אחידה, שיהוי קצר, והיסטופתולוגיותסימני ההיכר של בני אל ³⁰ GBM. ניטור אורך של צמיחת גידול in vivo מסייע בדיקות סמים פרה קליניות דרך נורמליזציה של מחזורי טיפול וניתוח כמותי של צמיחת גידולים בתגובה לטיפול ^40. אנחנו נקבע קינטיקה צמיחת גידול על ידי הדמיה פליטת אור אורך של עכברים שהוזרקו עם לוציפראז להביע האסטרוציטים בקליפת המוח. לכן, האסטרוציטים בקליפת המוח ומועצה לביטחון לאומי נגזרים מGEM המותנה לספק מערכת מודל צייתנית להגדרה של השלכות תפקודיות של המוטציות הקשורים אסטרוציטומה ומערכת מודל פוטנציאל לפיתוח תרופות פרה קליני.