Моделирование Астроцитома Патогенез<em> In Vitro</em> И<em> В Vivo</em> Использование кортикальной астроциты или нервные стволовые клетки из условного, генной инженерии мышей

Астроцитомы наиболее распространенной первичной опухоли головного мозга и глиобластомы (GBM), IV астроцитома класса, является наиболее распространенным и агрессивным подтипом при медиане выживаемости 12-15 месяцев ^1,2. Вторжение диффузных астроцитом, в частности GBM, исключает полное хирургическое удаление, ограничивает эффективность адъювантной терапии, и неизбежно приводит к рецидиву после лечения ^3. Пациенты, изначально присутствующие либо с De Novo (первичной) GBM или с более низкими астроцитом класса, что неизбежно прогрессирует в (вторичной) GBM ^4. GBM является геномно неоднородна и характеризуется взаимоисключающих и сопутствующих мутаций в генах, которые регулируют три основных сигнальных путей: G ₁ / S (Rb) клеточного цикла контрольных точек, рецептора тирозинкиназы (RTK), и TP53 дорожками ^5-7. GBM состоит из четырех геномных подтипов с различными профилями экспрессии, которые напоминают различные типы клеток мозга, предполагая, что GBM подтип ВЛИянием его клетки происхождения ^6,8,9. Лучшие модели астроцитома обязаны определить роль конкретных комбинаций мутаций в определенные клеточные типы во астроцитому патогенезе. Используя эти модели для более эффективного развития доклинических наркотиков в конечном итоге поможет улучшить результаты лечения пациентов. Современные модели астроцитома включают установлены клеточные линии человека, пациента происходит ксенотрансплантаты (PDX), генетически модифицированные нормальные человеческие астроциты и нервные стволовые клетки (НСК) и генно-инженерных мышей (GEM) ^10-14. Мы разработали альтернативный, не-зародышевой линии GEM (nGEM) модель ¹⁵ с использованием первичных клеток мозга – коры астроциты и NSC – найденным GEM, несущего различные комбинации floxed онкогенных аллелей. Целью было генерации моделей Астроцитома с генетически определенных клеток, которые могут быть фенотипически характеризующихся как в пробирке и в естественных и потенциально используемых для доклинической разработки лекарственных средств в Immune-компетентные мышей.

Штатные клеточные линии человека являются наиболее часто используется модель патогенеза астроцитому и ответ наркотиков в пробирке и в естественных условиях. Они технически прямо вперед, широко доступны, и определили кинетики и онкогенность на ортотопического ксенотрансплантации в иммунодефицитных мышей ^10,11,16-18 . Их недостатки включают неспособность генерировать установленные клеточные линии из низкосортных астроцитом, ограничивая исследование только к высокой астроцитом; Отсутствие определенной ячейке происхождения; наличие сложных геномных нарушений, часто с геномных профилей, которые заметно отличаются от оригинального образца пациента; и восприимчивость к фенотипической и генотипической дрейфа во серийного культуры в сыворотке ^11,17,19-22. Фенотипические последствия отдельных онкогенных мутаций в установленных клеточных линий человека GBM может маскироваться множества нарушений, которые на самом деле присутствует, которые часто исключает elucidation прямых последствий генотип-фенотип.

PDX генерируются через подкожной прохождения пациентом изолированы клетках астроцитомы в иммунодефицитных мышей или через их культуры как неадгезивных сфероидов в определенном, сыворотки среде до ортотопического инъекции в мозг иммунодефицитных мышей ^12,23. PDX более точно поддерживать геномной ландшафт человека астроцитомы, но аналогично установленных клеточных линий человека, фенотипический эффект отдельных онкогенных мутаций могут быть замаскированы в связи с их геномной сложности ^19,24. Чтобы определить фенотипические последствия конкретных онкогенных мутаций, особенно в ответ на новые методы лечения, панели, установленные клеточных линий или PDX человека часто используются, чтобы установить генотип-фенотип корреляции, показать обобщения, и свести к минимуму вероятность линии конкретных эффектов клеток. В то время как PDX точно воспроизводят гистопатологические признаки человеческой астроцитомы, IncЛУДИНГ вторжение, Ортотопическая ксенотрансплантаты из установленных клеточных линий человека вообще не ^21,23,25. Кроме того, нормальные человеческие астроциты и НСК были генной инженерии с определенными онкогенных мутаций моделировать Астроцитома туморогенез в пробирке и в естественных ^13,14,26. Эти клетки имеют геномную сложность установленных клеточных линий и PDX человека и точно воспроизводят человеческую Астроцитома гистопатологию, но требуют ксенотрансплантации в иммунодефицитных грызунов в естественных условиях. Потому что все модели клеток человека требуют иммунодефицитом грызунов для предотвращения иммунной опосредованного отторжения ксенотрансплантата, эти модели не резюмировать родные опухоли стромы взаимодействия сингенной системы и не имеют интактную иммунную систему, ограничивая доклинические исследования стромы целенаправленной и иммунной-модуляторных виды терапии, ^10,11.

GEM разрешение экспертиза фенотипических последствий заранее определенных комбинаций онкогенного Мутания в естественных условиях в течение на месте туморогенеза. В то время как не-условное GEM есть мутаций внутри всех тканях в течение всего развития, условно GEM уже floxed онкогенные аллели, которые позволяют адресности мутаций путем ограничения Cre-опосредованной рекомбинации определенными типами клеток путем использования типоспецифических промоутеров клеток ^10,11,15,18. Условный астроцитома GEM были использованы для выяснения функциональные роли онкогенных мутаций в различных типах клеток в интактным мозгом ^11. Доклинические полезность на месте gliomagenesis помощью условного GEM ограничивается рядом факторов, включая 1) Отсутствие коррелят в пробирке, 2) трудности в формировании большие когорты мышей со сложными генотипов, 3) с длительным латентным периодом в развитии опухоли Ситу , 4) и стохастического прогрессирование опухоли. Поскольку на месте канцерогенез отсутствует модель, соответствующую в пробирке, тестирование препарата в пробирке не может быть выполнена WIth обычные условные модели GEM. В отличие от других видов рака, условные модели GEM астроцитомы редко, индуцированный отдельных онкогенных мутаций ^11. Таким образом, сложные схемы размножения требуются для создания условного GEM с несколькими онкогенных мутаций. Кроме того, астроцитома инициация происходит с переменной пенетрантностью после длительного латентного в этих моделях, в то время как прогрессирование до высокого астроцитом обычно происходит в неоднородном, стохастического образом и в конечном итоге приводит к опухоли со сложными геномных пейзажей и стремительных кинетики роста ^{27, 28.} Переменная пенетрантность и стохастический характер злокачественной прогрессии в условных моделей GEM требует, чтобы отдельные мышей быть экранированы рентгенографии для обнаружения присутствия и местоположения высокого астроцитом до их зачисления в доклинических испытаний лекарств. Взятые вместе, эти ограничения препятствуют поколения и тестирование крупных когорт условного GEM, необходимое для прeclinical тестирование на наркотики.

GEM система RCAS-тва, которые использует птичьего ретровирусов (Rcas) векторы заразить GEM инженерии выразить вирусный рецептор (TVA) по конкретным нейронных типов клеток, широко используется для моделирования Астроцитома туморогенез ^11. В отличие от условного GEM, эта модель система позволяет введение нескольких онкогенных мутаций в определенных типах клеток без необходимости сложных схем селекции. Тем не менее, она ограничена переменной пенетрантностью, требование для активно делящихся клеток для достижения вирусного интеграции, и случайной вставки трансгенов в геном хозяина ^29.

Номера для зародышевой линии GEM (nGEM) модели, которые используют клетки, полученные из GEM, становятся все более важными, потому что они преодолеть многие из ограничений других модельных систем ^15. Роль инициирования типа клеток и сопутствующих мутаций в астроцитому патогенезе трудно сдерживатьшахта с использованием установленных клеточных линий GBM человека или PDX, потому что они являются производными от терминальной стадии опухоли, которые накопились обширные генетические мутации в неопределенных типов клеток в ходе злокачественной прогрессии. В отличие от этого, все сорта астроцитомы могут быть смоделированы с помощью nGEM путем индукции определяется генетические мутации в определенных очищенных типы клеток мозга ^11,30. Таким образом, влияние специфических генетических мутаций и типа клеток на клеточном и молекулярном фенотипов может быть определена в пробирке и в естественных условиях. Как и в установленных клеточных линий человека GBM, начальная пробирке тестирования на наркотики при помощи nGEM могут быть использованы по приоритетам препараты для тестирования в естественных условиях, использующие одни и те же клетки. Опухолей ин виво может быть определена путем аллотрансплантации nGEM клетки ортотопически в мозг иммунокомпетентных сингенных помета ^30. Эти Ортотопическая модели аллотрансплантатов поэтому позволяют в естественных условиях тестирования не только обычных цитотоксической ай целевой терапии, но иммунная-модуляторный и строме ориентированные виды терапии, а также. И, наконец, роль микроокружения на инициации и прогрессирования опухоли могут быть определены путем сравнения результатов между nGEM и обычные модели GEM с использованием тех же мутации в тех же типах клеток.

Мы и другие разработали Астроцитома nGEM использованием первичных клеток – астроцитов, NSC или клетки-предшественники олигодендроцитов (OPC) – найденным GEM ^30-34. Обоснованием разработке астроцитомой nGEM было создать модель для определения фенотипические последствия онкогенных мутаций в специфические типы клеток, которые потенциально могут быть использованы для доклинических испытаний препарата в пробирке и в естественных в иммунокомпетентных животных. Мы собрали фенотипически WT корковых астроциты и NSC от не-Cre выражающие, условное GEM поддерживается на> 94% C57 / BL6 фоне с floxed РБ пути – Rb1 ^{LoxP / LoxP} или TgGZT121 – и floxed RTK / РАН / PI3K пути – nf1 ^{LoxP / LoxP,} Крас ^G12D, PTEN ^{LoxP / LoxP} – гены в различных комбинациях ^35-39. Мы индуцированной генетической рекомбинации в пробирке с помощью аденовирусные векторы, кодирующие Cre рекомбиназу. Поскольку корковые астроцитов урожаи содержат смесь типов клеток, мы использовали Ad5GFAPCre векторы или доминирующие онкогенные трансгены, такие как TgGZT ₁₂₁ приводится в движение от промотора GFAP человека, для обогащения GFAP ⁺ кортикальных астроцитов в этих культурах. Мы определили фенотипические последствия G ₁ / S (РБ), MAPK, и пути PI3K мутаций в корковых астроциты и НСК в пробирке и в естественных условиях. МАРК и PI3K пути активированные G1 / S-неполноценные астроциты молекулярно передразнил человек пронейральный GBM и, по ортотопического инъекции, образованные опухоли в заранее определенном месте с единых кинетики роста, короткие задержки, и гистологическиеаль отличительными чертами человеческого GBM ^30. Продольный контроль роста опухоли в естественных условиях помогает доклинические испытания препарата через нормализации лечения когорт и количественного анализа роста опухоли в ответ на лечение ^40. Мы определили кинетики роста опухоли по продольной биолюминесценции визуализации мышей, которым вводили люциферазы выражая корковых астроциты. Поэтому корковых астроциты и НСК, полученные из условного GEM обеспечить послушный модельную систему для определения функциональных последствий астроцитомы мутаций, связанных и потенциального модельной системы для доклинической разработки лекарств.