Live-Imaging von<em> Drosophila</em> Larven Neuroblasten

Stammzellen ein Gleichgewicht der Differenzierung und Selbsterneuerung an zelluläre Vielfalt während der frühen Entwicklung zu generieren und ersetzen beschädigte Zellen in adulten Geweben. Verordnung dieser Homöostase verhindert sowohl den Verlust und die Überdehnung der Stammzellpopulation, die in schädlichen Gewebedegeneration oder Tumorentstehung führen kann.

Neuroblasten (NBS) sind die häufigsten untersuchten neuralen Stammzellen des zentralen Nervensystems von Drosophila (1A), die erste Form während der embryonalen Stufen ^{1, 2.} NBs unterziehen wiederholte Runden der asymmetrischen Zellteilung (ACD), um zwei ungleich seligen Zellen produzieren: eine sich selbst erneuernde Stammzelle und eine differenzierende Zelle. ACD wird von Zentrosomen, die nicht-membranöse Organellen, die als Mikrotubuli-organisierende Zentren der meisten Zellen ³ handeln geführt. Während der Mitose, NB Zentrosomen zu organisieren und orientieren den bipolaren mitotischen Spindel entlang der apikal-basalen Polarkeit Achse. Nach der Spaltung des Teilungs NB, apikal Schicksal Determinanten, die die Stammzell Schicksal angeben und basalen Schicksal Determinanten, die eine Differenzierung angeben, werden in die ungleiche Tochterzellen getrennt.

Im Larven zentrale Gehirn, können zwei Arten von NBs durch deren Anzahl, Lage, Transkriptionsfaktor-Expression und Zelllinie (Fig. 1A) ^4-6 unterscheiden. Typ-I-BS sind die häufigsten, und etwa 90 von ihnen bevölkern die vorderen und hinteren Seiten jeder Optik Lappen des Gehirns ^7. Diese NBs Ausdruck der Transkriptionsfaktor ASENSE (Ase), und sie charakteristisch in eine sich selbst erneuernde NB teilen und eine kleinere Ganglienmutterzelle (GMC; Abbildung 1B). Jeder GMC erfährt ein einziges Terminal Division zu zwei Neuronen oder Gliazellen (Abbildung 1B) zu generieren. Im Gegensatz dazu sind die acht Typ II NBs, die die hintere Seite jeder optischen Loben bevöl fehlt Ase Ausdruck ^5. Sie durchlaufen ACDauf eine sich selbst erneuernde NB und eine Zwischen neuralen Vorläufer (INP) zu produzieren.

Die INP wiederum teilt asymmetrisch drei-bis fünfmal. Jeder dieser Bereiche ergibt Regeneration des INP und der Herstellung eines einzigen GMC ^4. Zusammen die spezifische NB Identität und die zeitliche Reihenfolge der GMC Geburt führt zur neuronalen erstaunliche Vielfalt der erwachsenen ZNS.

Das Verständnis der Zellbiologie, die NB ACD zugrunde liegt, wurde erheblich durch den Einsatz von Live-Cell-Imaging-Techniken verbessert. Veröffentlicht Protokolle, die von Forschern, Live-Bild verwendet NBs sind sehr unterschiedlich. Insgesamt aber diese Verfahren können in zwei allgemeine Kategorien von, ob die Larven Gehirn intakt gelassen oder mechanisch dissoziiert unterschieden gruppiert werden. Beide Techniken haben unterschiedliche Vor-und Nachteile je nach Anwendung des Forschers.

Frühe Berichte enthüllt Live-NB Zellteilunggen beinhalten ein gewisses Maß an Hand Dissoziation des Larven Gehirn. Diese Protokolle Detail Verschmieren ⁸ oder ⁹ Hänseleien abgesehen, das Gehirn, um kurzfristige Primärkulturen von der NBS auf Deckgläsern wachsen. Um Bildgebung zu verbessern, werden die runden NBs der Regel auf die Deckgläser entweder mit Glasobjektträger ⁸ oder ⁹ Agarose-Pads abgeflacht. Obwohl abgeflachten Zellen Optik verbessert, diese Techniken oft NB mitotischen Defekten führen, einschließlich Regression der Teilungsfurche und die Unfähigkeit, mehr als einmal zu teilen. Daher sind Protokolle, die sowohl manuelle Dissoziation und physische Verzerrung des Larvenhirngewebe beinhalten in der Regel nur geeignet, um sehr kurzfristige (dh., Ein Zellzyklus oder weniger) Anwendungen. Ebenso semi-Quetschen oder vollständig intakten Gehirn Abflachung zwischen Glasobjektträger und Deckgläser begrenzt die Zeit, ein verbringen Abbildung einer gegebenen Probe zu einer etwa 30-minütigen Zeitraum ^10. Trotz dieser Einschränkung thiAnsatz erfolgreich ^11-14 verwendet.

Die jüngsten Bemühungen um Live-Bild dissoziiert NBs Grenze physischen Verzerrung der isolierten Zellen. Diese Techniken sind besonders nützlich für Anwendungen, bei denen es notwendig ist, um die Zellkulturen für mehrere Zellteilungszyklen aufrecht zu erhalten. Beispielsweise kann manuell aus dispergierten Zellen dissoziiert Gehirn teilweise in ein Gerinnsel aus dem Gemisch von Fibrinogen und Thrombin, ¹⁵ für die Langzeitabbildungs ^​​16 eingebettet werden. Alternativ kann explantierten Gehirne zunächst mit dem Enzym Collagenase, neben manuell durch wiederholte Passage durch eine Pipettenspitze aufgebrochen und anschließend auf Poly-L-Lysin beschichteten Glasbodenschalen ^{17, 18} plattiert chemisch getrennt werden. Die Beschichtung Glasschalen entweder mit Fibrinogen oder Poly-L-Lysin fördert die Bindung und leichten Verbreitung von Rundzellen, bringen sie so nah an der Deck wie möglich, ohne große körperliche Verzerrung. In additiauf beinhalten diese Verfahren das Kultivieren der NBS in Medium, das leicht für pharmakologische Experimente Störungs ¹⁸ ausgetauscht werden können. Insgesamt Plattierung direkt verteilt NBs verbessert Abbildungsoptik, ohne dabei langfristigen Imaging-Funktionen. Kürzlich wurde ein Protokoll beschreibt die langfristige Kultivierung von dissoziierten NBs wurde ¹⁹ beschrieben.

Jedoch ist dieser Ansatz nicht ohne Einschränkungen. Es gibt mehrere Einschränkungen live dissoziiert NBs Bildgebung. In einem Feld von dispergierten Zellen, beispielsweise ist es schwierig, bestimmte NB Linien, die räumlich in der intakten ¹ organisiert sind, zu identifizieren. Ebenso die Unterscheidung der Typ I gegen Typ-II-NBs in dissoziierten Gewebe ist auch ohne den Ausdruck der Abstammung oder Tracer-Subtyp-spezifischen Transgene, wie worniu-GAL4, asense-GAL80 ²⁰ herausfordernde. Obwohl diese Transgene sind sehr nützlich für einige Anwendungen, sie begrenzen Forscher diejenigen Transgene exunter der Kontrolle von UAS-Enhancer-Element ²¹ gedrückt und erfordern komplexe genetische Systeme. Studien, die die räumliche und zeitliche Entwicklung des NBs betreffen, erfordern daher in vivo-Bildgebung im Kontext eines intakten Gewebes.

Außerdem haben Studien dissoziierter embryonaler NBs anzuzeigen, dass der physische Kontakt benachbarter Zellen ist für die Zwischen Lokalisierung von Schlüsselfaktoren Polarität ^{22, 23.} Diese Studien zeigen, völlig isoliert NBs die invariante mitotischen Spindelachse nicht mehr aufrecht zu erhalten. Stattdessen werden diese Zellen zeigen eine weitere randomisierte Spindelachse und großen Winkeln der Trennung zwischen aufeinander GMC Knospen, vielleicht aufgrund des Verlustes der apikalen Zentrosom Positionierungs ^22. Obwohl die Beziehung zwischen den Larven NBs und ihre Nachbarzellen nicht ausführlich untersucht worden, ist es eine Überlegung wert, dass die Larvenstammzellmikroumgebung kann von Zellpolarität oder andere treffenVerhaltensweisen. Um die physiologischen Kontext der Larven NBs halten wir Bild ACD aus ganzen Gehirne.

Angesichts der inhärenten Einschränkungen mit bildgebenden dissoziiert NBs verbunden sind, haben unser Labor und andere Protokolle für Bild in aufeinanderfolgenden Runden der NB ACD aus ganzen Larven Gehirn etabliert. Techniken zur Bild intakten Gehirn ersetzen häufig die starre Oberfläche aus Glas auf der einen Seite der Kulturkammer mit einer flexiblen Membran, um Gewebe Verformung oder Beschädigung zu verhindern und eine für den Gasaustausch. Einige Verfahren beinhalten Montage explantierten Gehirne in einem Gemisch von Insektenkulturmedium, Serum und Ascorbinsäure mit den Fettkörpern von zehn Larven ²⁴ isoliert. Die isolierten Fettkörper hinzugefügt werden, weil sie eine Mitogen bekannt, NB Zellteilung stimulieren ²⁵ absondern. Dieses Protokoll bewahrt die Integrität des Gewebes über 3 Stunden und ist daher offen für Langzeitabbildungs ^{​​24, 26-28.} Kürzlich wurde ein Protokoll beschreibt die long fristigen Abbildung des Larven intakten Gehirn in Gegenwart von Ascorbinsäure, Serum und Fettkörper wurde ²⁹ detailliert. Wichtig ist, da das Gewebe nicht ausgesetzt oder immobilisiert ist dieser Ansatz weniger nützlich für Anwendungen, in denen Kulturmedium ausgetauscht wird (z. B. Arzneimittelstudien Immunodepletion usw.).

Unser Labor hat die ganze Vorbereitung der Live-Halterung Larven Gehirne für langfristige Bildgebung ^{30, 31} vereinfacht. Der Hauptvorteil unseres Protokolls über andere ist seine Einfachheit: Unsere Beobachtungen zeigen, weder Serum, Ascorbinsäure, Insulin, noch Fettkörper sind notwendig, Zusatzstoffe Bild aufeinanderfolgende Runden NB ACD. Obwohl Additive, wie Insulin, wurden für die verlängerte Bildgebungs der Stammzellen Abteilungen ³² und kollektive Zellmigration in Drosophila Ovarien ³³ nützlich erscheinen sie entbehrlich für NB ACD sein, wie unsere Abbildungsmedium besteht aus einer einfachen Mischung von STAndard Insektenzellkulturmedium mit Antibiotika-Antimykotikum ergänzt werden, um eine Kontamination zu verhindern. Durch die Verwendung von wiederverwendbaren gasdurchlässige oder Glasboden Kulturschalen, haben wir in der Lage, mehrere Runden von aufeinanderfolgenden NB ACD zu erhalten. Die gleichen explantiert Proben können leicht für Immunfluoreszenz-und andere Verfahren mit festen Gewebe verwendet werden. In diesem Protokoll, die wir ausführlich die Präparation von intakten Larven Gehirn, sowie die Vorbereitung der Gehirne sowohl für Live-und Festanalyse.