Живая съемка<em> Дрозофилы</em> Личиночные нейробласты

Стволовые клетки поддерживать баланс дифференциации и самообновление генерировать сотовой разнообразие во время раннего развития и заменить поврежденные клетки во взрослых тканях. Регулирование этого гомеостаза предотвращает как потери и над-расширение популяции стволовых клеток, что может привести к вредным дегенерации тканей или опухолей.

Нейробластов (NBS) являются широко изучены нервные стволовые клетки Drosophila центральной нервной системы (рис. 1А), что первые формы во время эмбриональных стадий ^{1, 2.} NBs пройти неоднократные вспышки асимметричных клеточных делений (ACD) для получения двух неравномерно суждено клетки: самообновлению стволовых клеток и дифференциации клеток. ACD руководствуется центросомах, не-мембранных органелл, которые действуют как микротрубочки организующих центрах большинства клеток ^3. Во время митоза, NB центросомы организовать и ориентировать биполярного митотическое веретено вдоль апикально-базальной полярнаяОсь ность. При отщеплении разделяющей NB, верхушечные судьба детерминанты, определяющие судьбу стволовых клеток и базальных судьба детерминанты, определяющие дифференциацию, выделяются в неравных дочерних клеток.

В личиночной центральной мозга, два типа NBs можно отличить по их числу, должность, выражения фактора транскрипции, и клеточной линии (рис. 1А) ^4-6. Тип I NBs являются наиболее распространенными, и около 90 из них заполнить переднюю и заднюю стороны каждого зрительного доли головного мозга ^7. Эти NBs выразить транскрипционный фактор Asense (ASE), и они характерно разделить на одной самообновляющейся NB и один меньше ганглий материнская клетка (GMC; рис. 1В). Каждый GMC подвергается одной дивизии терминала генерировать два нейрона или глии (рис. 1b). В отличие от этого, НБС восемь Type II, которые населяют заднюю сторону каждой оптической доле хватает ASE выражение ^5. Они проходят ACDДля производства одного самообновлению NB и один промежуточный нейронной прародителя (ИЯФ).

ИЯФ, в свою очередь, делит асимметрично три-пять раз. Каждый из этих отделов приводит к регенерации ИЯФ и производства одного GMC ^4. В совокупности конкретных идентичность NB и временной порядок GMC рождения приводит к поразительному разнообразию нейронов взрослого центральной нервной системы.

Понимание клеточной биологии, что лежит в основе NB ACD была значительно улучшена за счет использования живых методов визуализации клеток. Опубликованные протоколы, используемые исследователями к фото живых NBs варьироваться в широких пределах. В целом, однако, эти методы могут быть сгруппированы в две основные категории, отличающихся личиночной мозг остается ли нетронутыми или механически диссоциируют. Оба метода имеют свои преимущества и недостатки в зависимости от применения исследователя.

Ранние сообщения, раскрывающие живой NB клеток DIVIsions подразумевают некоторую степень ручного диссоциации личиночной мозга. Эти протоколы деталь размазывая ⁸ или дразнить друг от друга ⁹ мозг, чтобы расти краткосрочные первичных культур НБС на покровные стекла. Для улучшения визуализации, круглые NBs обычно сжатая с покровные с либо стеклах ⁸ или геле колодки ^9. Хотя уплощенных клеток улучшили оптику, эти методы часто приводят к NB митотических дефектов, в том числе регрессии щели расхождения и невозможности разделить более чем один раз. Таким образом, протоколы, связанные как ручной диссоциации и физическое искажение личиночной мозговой ткани, как правило, только подходит для очень краткосрочные (т.е.., Один клеточный цикл или меньше) приложения. Кроме того, полу-недопустимыми или полностью уплощение неповрежденные мозги между стеклах и покровные ограничивает время можно потратить с изображениями данного образца к примерно 30-минутного периода ^10. Несмотря на это ограничение, Тхис подход успешно используется ^11-14.

Недавние усилия, чтобы жить изображений в отрыве предел NBS физическое искажение изолированных клеток. Эти методы особенно полезны для приложений, где необходимо поддерживать клеточных культур для нескольких циклов деления клеток. Например, диспергированные клетки из диссоциированных вручную мозга может быть частично встроен в сгусток, изготовленного из смеси фибриногена и тромбина ¹⁵ для долгосрочного изображений ^16. Кроме того, эксплантированной мозг может быть сначала химически диссоциирует с ферментом коллагеназой, следующий вручную путем многократного нарушенного прохождении через концом пипетки, а затем высевали на поли-L-лизин покрытием со стеклянным дном блюда ^{17, 18.} Покрытие стеклянной посуды либо фибриногена или поли-L-лизина способствует прикреплению и небольшое распространение круглых клеток, в результате чего их как можно ближе к покровным как можно без больших физических искажений. В дополнительна эти способы включают культивирование НБС в среде, которая может быть легко обменены на фармакологических экспериментов возмущений ^18. В целом, непосредственно покрытие разошлись NBs улучшает изображений оптики без ущерба для долгосрочных возможности визуализации. В последнее время это протокол, описывающий долгосрочную культивирование диссоциированном NBs был подробно описан ^19.

Однако этот подход не лишен ограничений. Есть несколько предостережений, чтобы изображений живых разложенных NBs. В поле диспергированных клеток, например, трудно определить конкретные NB клоны, которые пространственно организованных в интактном мозге ^1. Кроме того, различия типа я против Тип NBS II в рамках диссоциированном ткани также представляет значительную проблему без выражения клона индикаторов или подтипа конкретных трансгенов, таких как worniu-GAL4, asense-GAL80 ^20. Хотя эти трансгены весьма полезны для некоторых применений, они ограничивают исследователей тех трансгенов экспрессуют под контролем энхансера UAS элемента ²¹ и требуют более сложных схем генетические. Исследования, которые касаются пространственного или временного развитие NBs, следовательно, требуют в естественных изображений в контексте интактной ткани.

Более того, исследования диссоциированных эмбриональных NBs показывают, что физический контакт соседних клеток имеет решающее значение для интерфаза локализация ключевых полярности детерминанты ^{22, 23.} Эти исследования показывают, полностью изолированы NBs больше не поддерживать инвариант ось митотического веретена. Вместо этого, эти клетки отображать более рандомизированных оси шпинделя и широкие углы разделения между последовательными почек GMC, возможно, связано с потерей апикальной центросом позиционирования ^22. Хотя отношения между личиночной NBs и их соседних клеток не была изучена, стоит учесть, что личинок микросреда стволовых клеток может посягать на клеточной полярности или другихповедения. Для поддержания физиологического контекст личиночной NBs, мы изображение ACD из цельных мозгов.

Учитывая присущие ограничения, связанные с изображениями в отрыве NBs, наша лаборатория и другие разработали протоколы для изображения последовательных раундов NB ACD из целых личинок мозгов. Методы к изображению мозга интактных часто заменять жесткой поверхности стекла на одной стороне культуральной камере с гибкой мембраны, чтобы предотвратить искажение ткани или повреждений и позволяют для газообмена. Некоторые способы включают монтажа эксплантированной мозги в смеси с насекомыми культивирования среды, сыворотка, и аскорбиновой кислоты с жиром органов, выделенных из десять личинок ^24. Выделенные жира тела добавляются, потому что они выделяют митоген известно, стимулирует NB деление клеток ^25. Этот протокол сохраняет целостность ткани свыше 3 часов, а, следовательно, поддаются долгосрочному изображений ^{24, 26-28.} В последнее время это протокол, описывающий долготаг-термин изображений интактных личинок мозга в присутствии аскорбиновой кислоты, сыворотки и жировых тел была подробно ^29. Важно отметить, что, так как ткань не является ни подвергается ни стопорится, такой подход является менее полезны для приложений, где происходит обмен культивирование среднего (например, исследований наркотиков, immunodepletion и др.).

Наша лаборатория упростил всю подготовку монтирования живых личинок мозгов для долгосрочного изображений ^{30, 31.} Главное преимущество нашего протокола над другими является его простота: наши наблюдения показывают, ни сыворотку, аскорбиновую кислоту, инсулин, ни жира тела являются необходимые добавки к фото последовательных раундов NB ACD. Хотя добавки, такие как инсулин, были полезны для длительного визуализации стволовых клеточных делений ³² и коллективной миграции клеток в дрозофилы яичников ^33, они, кажется, безразличен для NB ACD, как наш изображений среда состоит из простой смеси станцийndard насекомое культивирования клеток, дополненной антибиотика-противогрибкового для предотвращения загрязнения. Благодаря использованию многоразовых газопроницаемой или стеклянным дном чашки для культивирования, мы были в состоянии выдержать несколько раундов последовательных NB ACDS. Те же образцы эксплантированной легко может быть использован для иммунофлуоресценции и других процедур с фиксированной ткани. В этом протоколе, мы подробно рассечение интактных личинок мозгов, а также подготовка мозги как для живой и фиксированной анализа.