Live-Imaging van<em> Drosophila</em> Larvale neuroblasts
Summary
Dit protocol Gegevens een gestroomlijnde methode voor live cell imaging uitvoeren in het kader van een intact larvale hersenen. Live cell imaging benaderingen zijn van onschatbare waarde voor de studie van asymmetrische neurale stamcellen divisies evenals andere neurogene en ontwikkelingsprocessen, consequent blootleggen van mechanismen die eerder over het hoofd gezien.
Abstract
Stamcellen verdelen asymmetrisch twee nakomelingen cellen met ongelijke lot potentieel te genereren: een zelfvernieuwende stamcel en een differentiërende cel. Gezien hun relevantie voor ontwikkeling en ziekte, het begrijpen van de mechanismen die bepalen asymmetrische stamcellen divisie heeft een robuust gebied van studie geweest. Omdat ze genetisch handelbaar ondergaan opeenvolgende ronden van celdeling ongeveer eenmaal per uur, de stamcellen van de Drosophila centrale zenuwstelsel of neuroblasts, onmisbaar modellen voor de studie van stamcellen celdeling. Ongeveer 100 neurale stamcellen zijn gelegen nabij het oppervlak van elk van de twee lobben larvale hersenen, waardoor dit modelsysteem bijzonder bruikbaar voor levende beeldvorming microscopie studies. In dit werk, bespreken we verschillende benaderingen op grote schaal gebruikt om stamcellen divisies visualiseren, en we pakken de relatieve voor-en nadelen van de technieken die in dienst gedistantieerd versus intacte hersenen weefsels. We hebben ook detail onze simplifIED protocol dat wordt gebruikt om hele hersenen explanteren uit derde instar larven voor live cell imaging en vaste analyse toepassingen.
Introduction
Stamcellen handhaven van een balans tussen differentiatie en zelfvernieuwing om cellulaire diversiteit te genereren tijdens de vroege ontwikkeling en beschadigde cellen in volwassen weefsels. Regulering van deze homeostase voorkomt zowel verlies en over-expansie van de stamcelpopulatie, wat kan leiden tot schadelijke weefsel degeneratie of tumorvorming.
Neuroblasts (NBs) zijn uitgebreid bestudeerd neurale stamcellen van de Drosophila centrale zenuwstelsel (figuur 1A) die eerste vorm tijdens embryonale stadia 1, 2. NBs ondergaan herhaalde rondes van asymmetrische celdeling (ACD) tot twee ongelijk gedoemd cellen produceren: een zelfvernieuwende stamcel en een differentiërende cel. ACD wordt geleid door centrosomes de niet-membraneuze organellen die fungeren als microtubuli-organiserende centra van de meeste cellen 3. Tijdens de mitose, NB centrosomes organiseren en oriënteren de bipolaire mitotische spoel langs de apicale-basale polaireteit as. Na splitsing van het verdelen van NB, apicale lot determinanten die de stamcellen lot specificeren, en basale lot determinanten die differentiatie opgeeft, worden gescheiden in de ongelijke dochtercellen.
In het larvale centrale hersenen, kan twee soorten AI's worden onderscheiden door hun aantal, plaats, transcriptiefactor expressie en cellijn (Figuur 1A) 4-6. Type I NBs zijn de meest voorkomende, en ongeveer 90 van hen bevolken de voorste en achterste zijden van elk optische kwab van de hersenen 7. Deze AI's drukken de transcriptiefactor Asense (Ase), en ze karakteristiek verdelen in een zelfvernieuwende NB en een kleinere ganglion moeder cel (GMC; Figuur 1B). Elke GMC ondergaat een enkele terminal divisie twee neuronen of glia (Figuur 1B) te genereren. Daarentegen acht Type II NBs dat de achterste zijde van elke optische kwab stijging gebrek Ase expressie 5. Ze ondergaan ACDeen zelfvernieuwende NB en een tussen neurale voorlopercellen (INP) produceren.
De INP beurt asymmetrisch drie tot vijf keer. Elk van deze afdelingen leidt regeneratie van de INP en de productie van een GMC 4. Gezamenlijk specifieke NB identiteit en de temporele volgorde GMC baart tot de verbazingwekkende neuronale diversiteit van de volwassen centrale zenuwstelsel.
Inzicht in de celbiologie dat NB ACD ten grondslag ligt is sterk verbeterd door het gebruik van live-cell imaging technieken. Gepubliceerde protocollen gebruikt door onderzoekers op de foto voor live AI's lopen sterk uiteen. Kortom, maar deze werkwijzen kunnen worden ingedeeld in twee algemene categorieën onderscheiden door of de larvale hersenen intact wordt gelaten of mechanisch gedissocieerd. Beide technieken hebben verschillende voor-en nadelen, afhankelijk van de toepassing van de onderzoeker.
Vroege rapporten een onthullende live NB cel divilingen tot op zekere mate van handmatige dissociatie van de larvale hersenen. Deze protocollen detail vegen 8 of plagen elkaar 9 van de hersenen om op korte termijn primaire culturen van de AI's op dekglaasjes groeien. Om beeldvorming te verbeteren, zijn de ronde NBs meestal afgeplat op de dekglaasjes met ofwel glasplaatjes 8 of agarose pads 9. Hoewel afgeplatte cellen optiek verbeterd, deze technieken leidt vaak tot NB mitotische afwijkingen, waaronder regressie van de splitsing groef en het onvermogen om meer dan een keer te verdelen. Daarom protocollen die zowel handmatig dissociatie en fysieke verstoring van de larvale hersenweefsel te betrekken zijn over het algemeen alleen geschikt voor zeer korte termijn (dat wil zeggen., Een celcyclus of minder) toepassingen. Ook semi-kneuzingen of volledig afvlakking intacte hersenen tussen glas dia's en dekglaasjes beperkt de tijd die men kan besteden beeldvorming van een bepaald monster aan een ongeveer 30 min. periode 10. Ondanks deze beperking, thiDe aanpak is succesvol 11-14 gebruikt.
Recente inspanningen om het leven los NBs limiet fysieke verstoring van de geïsoleerde cellen. Deze technieken zijn bijzonder nuttig voor toepassingen waarbij het nodig is celculturen ondersteunen voor meerdere celdeelcycli. Bijvoorbeeld kan gedispergeerde cellen van handmatig gescheiden hersenen gedeeltelijk ingebed in een stolsel gemaakt van het mengsel van fibrinogeen en thrombine 15 voor langdurige weergave 16. Alternatief kan geëxplanteerde hersenen eerst chemisch gedissocieerd met het enzym collagenase, naast handmatig verstoord door herhaalde passage door een pipetpunt en vervolgens uitgeplaat op poly-L-lysine beklede glazen bodem schotels 17, 18 zijn. Coating glazen schalen met ofwel fibrinogeen of poly-L-lysine bevordert de hechting en geringe verspreiding van ronde cellen, waardoor ze zo dicht mogelijk bij het dekglaasje mogelijk zonder grote fysieke vervorming. In additiop, deze methodes is het kweken van de AI's in medium dat gemakkelijk kunnen worden ingewisseld voor farmacologische verstoring experimenten 18. Over het algemeen, direct plating verspreid NBs verbetert beeldvorming optiek zonder in te boeten op lange termijn imaging-mogelijkheden. Onlangs heeft een protocol waarin de langdurige kweken van gedissocieerde NBs zijn uitgewerkt 19.
Deze benadering is niet zonder beperkingen. Er zijn verschillende kanttekeningen om live los NBs beeldvorming. Op een gebied van gedispergeerde cellen, bijvoorbeeld, is het moeilijk specifieke NB lijnen die ruimtelijk georganiseerd in de intacte hersenen 1 identificeren. Ook onderscheiden de Type I versus type II AI's binnen gedissocieerde weefsel is ook uitdagend, zonder de uitdrukking van lineage tracers of subtype-specifieke transgenen, zoals worniu-GAL4, asense-GAL80 20. Hoewel deze transgenen zijn zeer nuttig voor sommige toepassingen, ze onderzoekers beperken tot die transgenen afgedrukt onder de controle van de UAS enhancer element 21 en vereisen meer complexe genetische systemen. Studies die betrekking hebben op de ruimtelijke of temporele ontwikkeling AI's vergen dus in vivo in het kader van een intact weefsel.
Daarnaast hebben studies gedissocieerde embryonale NBs blijkt dat het fysieke contact van aangrenzende cellen is cruciaal voor de interfase lokalisatie van belangrijke determinanten polariteit 22, 23. Deze studies tonen volledig geïsoleerd NBs de invariante mitotische spindel-as niet meer te handhaven. In plaats daarvan, deze cellen vertonen een gerandomiseerde spilas en brede hoeken scheiding tussen opeenvolgende GMC knoppen, misschien door het verlies van apicale centrosome positionering 22. Hoewel de relatie tussen de larvale AI's en hun naburige cellen is niet uitgebreid zijn onderzocht, is het gezien het feit dat de larvale stamcel micro-omgeving kan van invloed zijn op cel polariteit of andere waardgedrag. Om de fysiologische context van larvale NBs te behouden, we afbeelding ACD van hele hersenen.
Gezien de inherente beperkingen in verband met beeldvorming gedissocieerde AI's, hebben ons lab en anderen protocollen opgesteld om de afbeelding opeenvolgende ronden van NB ACD uit hele larvale hersenen. Technieken om het intacte hersenen vaak vervangen de starre oppervlaktelaag van het glas aan een zijde van de kweekkamer met een flexibel membraan om weefsel verstoring of schade te voorkomen en zorgen voor gasuitwisseling. Sommige werkwijzen omvatten montage geëxplanteerd hersenen in een mengsel van insecten kweekmedium, serum en ascorbinezuur met het vet organen geïsoleerd uit tien larven 24. De geïsoleerde vet lichamen worden toegevoegd omdat ze scheiden een mitogeen bekend aan NB celdeling 25 stimuleren. Dit protocol blijft de integriteit van het weefsel gedurende 3 uur en is derhalve vatbaar voor langdurige weergave 24, 26-28. Onlangs heeft een protocol waarin de lonG termijn beeldvorming van intacte larvale hersenen in aanwezigheid van ascorbinezuur, serum, en vet lichamen is uitgewerkt 29. Belangrijk, omdat het weefsel niet blootgesteld of geïmmobiliseerd is deze benadering minder geschikt voor toepassingen waarbij kweekmedium wordt uitgewisseld (bijvoorbeeld drugstudies, immunodepletie enz.).
Ons laboratorium heeft de ganse berg voorbereiding van levende larvale hersenen voor de lange termijn imaging 30, 31 vereenvoudigd. Het belangrijkste voordeel van ons protocol over anderen is zijn eenvoud: onze waarnemingen wijzen noch serum, ascorbinezuur, insuline, noch vet lichamen zijn nodig additieven op de foto opeenvolgende ronden van NB ACD. Hoewel toevoegsels, zoals insuline, zijn nuttig voor het aanhoudende beeldvorming van stamcellen celdelingen 32 en collectieve celmigratie in Drosophila eierstokken 33 zijn, lijken ze overbodig voor NB ACD te zijn, als onze beeldmedium bestaat uit een eenvoudig mengsel van standard insect celkweek medium aangevuld met antibiotica-antimycotische om besmetting te voorkomen. Door het gebruik van herbruikbare gas-permeabel of glazen bodem cultuur gerechten, hebben we in staat om een aantal rondes van opeenvolgende NB ACD's ondersteunen geweest. Dezelfde geëxplanteerde monsters kunnen gemakkelijk worden gebruikt voor immunofluorescentie en andere procedures met vaste weefsel. In dit protocol gedetailleerde weergave van de ontleding van intacte larvale hersenen, evenals de bereiding van hersenen van zowel levende en vaste analyse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Live cell imaging is een waardevolle benadering gebruikt om de mechanismen die ACD van stamcellen, de differentiatie van cellijnen reguleren te bestuderen, en de morfogenese van complexe weefsels. Hoewel onderzoeksgroepen verleden zijn gebruikt verschillende technieken om te visualiseren NB ACD, kunnen deze benaderingen algemeen worden ingedeeld in twee categorieën die vooral verschillen met betrekking tot de vraag of het hersenweefsel intact wordt gelaten of gescheiden.
Imaging los NBs hee…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de verdeling van de intramurale onderzoek aan de National Institutes of Health / NHLBI (1ZIAHL006126) en een Lenfant Biomedische Postdoctoraal Fellowship toegekend aan DAL.
Materials
| Lumox Tissue Culture Dish 50X12 mm | Sarstedt | 94.6077.410 | A reusable culture dish with a gas-permeable and optically clear film base. |
| Schneider's S2 Medium | Invitrogen | 21720-024 | |
| Gibco Antibiotic-Antimycotic (100x) | Invitrogen | 15240-062 | A supplement containing penicillin (10,000 U/mL), streptomycin (10,000 mg/mL), and amphotericin B (25 mg/mL) that is added to Schneider's S2 media to prevent bacterial and fungal contamination. |
| Glass coverslips, #1.5 22X22 mm | Fisher Scientific | 12-541-B | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898 | A high viscosity inert oil that is clear and colorless. |
| pair of nickel-plated pin holders, 17 cm long | Fine Science Tools | 26018-17 | |
| Minutien dissecting pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| pair of Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Dissecting needle/probe with plastic handle | Fisher Scientific | 08-965-A | |
| Syringe filter, 0.22 mm pore size | Fisher Scientific | 09-719A | |
| Syringe 5 mL | BD Biosciences | 309646 | |
| plastic transfer pipet | Fisher Scientific | S30467-1 | |
| paraformaldehyde, 32% EM-grade | Electron Microscopy Sciences | 15714 | CAUTION: Formaldehyde is toxic; it should be handled in a fume hood. Follow MSDS guidelines for safe handling. |
| DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | A dye that labels DNA and is excited by UV light. |
| Aqua/PolyMount; Polysciences, Inc. | Fisher Scientific | 18606-20 | A water-soluble mounting medium. |
References
- Truman, J. W., Bate, M. Spatial and temporal patterns of neurogenesis in the central nervous system of Drosophila melanogaster. Developmental Biology. 125, 145-157 (1988).
- Doe, C. Q. Molecular markers for identified neuroblasts and ganglion mother cells in the Drosophila central nervous system. Development. 116, 855-863 (1992).
- Lerit, D. A., Smyth, J. T., Rusan, N. M. Organelle asymmetry for proper fitness, function, and fate. Chromosome research. 21, 271-286 (2013).
- Bello, B. C., Izergina, N., Caussinus, E., Reichert, H. Amplification of neural stem cell proliferation by intermediate progenitor cells in Drosophila brain development. Neural development. 3, 5 (2008).
- Bowman, S. K., et al. The tumor suppressors Brat and Numb regulate transit-amplifying neuroblast lineages in Drosophila. Developmental Cell. 14, 535-546 (2008).
- Boone, J. Q., Doe, C. Q. Identification of Drosophila type II neuroblast lineages containing transit amplifying ganglion mother cells. Dev Neurobiol. 68, 1185-1195 (2008).
- Homem, C. C., Knoblich, J. A. Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology. Development. 139, 4297-4310 (2012).
- Savoian, M. S., Rieder, C. L. Mitosis in primary cultures of Drosophila melanogaster larval neuroblasts. Journal of Cell Science. 115, 3061-3072 (2002).
- Fleming, S. L., Rieder, C. L. Flattening Drosophila cells for high-resolution light microscopic studies of mitosis in vitro. Cell Motil Cytoskeleton. 56, 141-146 (2003).
- Buffin, E., Lefebvre, C., Huang, J., Gagou, M. E., Karess, R. E. Recruitment of Mad2 to the kinetochore requires the Rod/Zw10 complex. Current biology. 15, 856-861 (2005).
- Basto, R., et al. Flies without centrioles. Cell. 125, 1375-1386 (2006).
- Lucas, E. P., Raff, J. W. Maintaining the proper connection between the centrioles and the pericentriolar matrix requires Drosophila centrosomin. J. Cell Biol. 178, 725-732 (2007).
- Basto, R., et al. Centrosome amplification can initiate tumorigenesis in flies. Cell. 133, 1032-1042 (2008).
- Conduit, P. T., Raff, J. W. Cnn dynamics drive centrosome size asymmetry to ensure daughter centriole retention in Drosophila neuroblasts. Curr. Biol. 20, 2187-2192 (2010).
- Forer, A., Pickett-Heaps, J. D. Cytochalasin D and latrunculin affect chromosome behaviour during meiosis in crane-fly spermatocytes. Chromosome research. 6, 533-549 (1998).
- Rebollo, E., et al. Functionally unequal centrosomes drive spindle orientation in asymmetrically dividing Drosophila neural stem cells. Dev. Cell. 12, 467-474 (2007).
- Januschke, J., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. Drosophila neuroblasts retain the daughter centrosome. Nat. Commun. 2, 243 (2011).
- Januschke, J., et al. Centrobin controls mother-daughter centriole asymmetry in Drosophila neuroblasts. Nat Cell Biol. 15, 241-248 (2013).
- Homem, C. C., Reichardt, I., Berger, C., Lendl, T., Knoblich, J. A. Long-Term Live Cell Imaging and Automated 4D Analysis of Drosophila Neuroblast Lineages. PLoS One. 8, (2013).
- Neumuller, R. A., et al. Genome-wide analysis of self-renewal in Drosophila neural stem cells by transgenic RNAi. Cell Stem Cell. 8, 580-593 (2011).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Siegrist, S. E., Doe, C. Q. Extrinsic cues orient the cell division axis in Drosophila embryonic neuroblasts. Development. 133, 529-536 (2006).
- Broadus, J., Doe, C. Q. Extrinsic cues, intrinsic cues and microfilaments regulate asymmetric protein localization in Drosophila neuroblasts. Curr. Biol. 7, 827-835 (1997).
- Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control. Molecular biology of the cell. 16, 5127-5140 (2005).
- Britton, J. S., Edgar, B. A. Environmental control of the cell cycle in Drosophila: nutrition activates mitotic and endoreplicative cells by distinct mechanisms. Development. 125, 2149-2158 (1998).
- Siller, K. H., Doe, C. Q. Lis1/dynactin regulates metaphase spindle orientation in Drosophila neuroblasts. Developmental Biology. 319, 1-9 (2008).
- Cabernard, C., Doe, C. Q. Apical/basal spindle orientation is required for neuroblast homeostasis and neuronal differentiation in Drosophila. Dev. Cell. 17, 134-141 (2009).
- Januschke, J., Gonzalez, C. The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts. J. Cell Biol. 188, 693-706 (2010).
- Cabernard, C., Doe, C. Q. Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila. Cold Spring Harb Protoc. 2013, 970-977 (2013).
- Rusan, N. M., Akong, K., Peifer, M. Putting the model to the test: are APC proteins essential for neuronal polarity, axon outgrowth, and axon targeting. J. Cell Biol. 183, 203-212 (2008).
- Lerit, D. A., Rusan, N. M. PLP inhibits the activity of interphase centrosomes to ensure their proper segregation in stem cells. J. Cell Biol. 202, 1013-1022 (2013).
- Morris, L. X., Spradling, A. C. Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary. Development. 138, 2207-2215 (2011).
- Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging. Nat. Protoc. 2, 2467-2473 (2007).
- Rusan, N. M., Peifer, M. A role for a novel centrosome cycle in asymmetric cell division. J. Cell Biol. 177, 13-20 (2007).
- Martinez-Campos, M., Basto, R., Baker, J., Kernan, M., Raff, J. W. The Drosophila pericentrin-like protein is essential for cilia/flagella function, but appears to be dispensable for mitosis. J. Cell Biol. 165, 673-683 (2004).
- Dix, C. I., Raff, J. W. Drosophila Spd-2 recruits PCM to the sperm centriole, but is dispensable for centriole duplication. Curr. Biol. 17, 1759-1764 (2007).
- Moutinho-Santos, T., Sampaio, P., Amorim, I., Costa, M., Sunkel, C. E. In vivo localisation of the mitotic POLO kinase shows a highly dynamic association with the mitotic apparatus during early embryogenesis in Drosophila. Biol. Cell. 91, 585-596 (1999).
- Megraw, T. L., Kilaru, S., Turner, F. R., Kaufman, T. C. The centrosome is a dynamic structure that ejects PCM flares. J. Cell Sci. 115, 4707-4718 (2002).
