Analyseur portable à base d'impédance en temps réel comme un outil pour délimiter voies moléculaires impliquées dans la neurotoxicité et la neuroprotection dans une lignée cellulaire neuronale
Summary
Improved in vitro neurotoxicity assays would aid the identification of new neuroprotective compounds. The utility of a real-time impedance-based cell analyzer to determine cytotoxicity and cytoprotection in neuronal cell lines and to delineate the involvement of second messenger pathways, thus gaining insight in the mechanism of neuroprotection is presented.
Abstract
De nombreux troubles liés au cerveau ont mort des cellules neuronales impliquées dans leur physiopathologie. Amélioration des modèles in vitro pour étudier les effets neuroprotecteurs ou neurotoxiques de drogues et les voies en aval concernés aiderait mieux comprendre les mécanismes moléculaires de neuroprotection / neurotoxicité et pourrait faciliter le développement de médicaments. Cependant, de nombreux tests in vitro existantes sur la toxicité comportent des limites importantes – plus évaluer la neurotoxicité et la neuroprotection à un seul point du temps, ne permettant pas d'observer l'évolution temporelle et la cinétique de l'effet. En outre, la possibilité de recueillir des informations sur les voies de signalisation impliquées dans la neuroprotection aval en temps réel serait d'une grande importance. Dans le protocole en vigueur, nous décrivons l'utilisation d'une cellule d'analyse en fonction de l'impédance en temps réel pour déterminer les effets neuroprotecteurs de la serotonine 2A (5-HT 2A) des agonistes du récepteur dans une lignée de cellules neuronales dans le cadre sans marquage et en temps réel conditions à l'aide de mesures d'impédance. De plus, nous démontrons que les inhibiteurs de la seconde piste de messagerie peuvent être utilisés pour délimiter les molécules en aval impliqués dans l'effet neuroprotecteur. Nous décrivons également l'utilité de cette technique pour déterminer si un effet sur la prolifération cellulaire contribue à un effet neuroprotecteur observé. Le système utilise des plaques spéciales microélectroniques dénommé E-plaques qui contiennent alternance réseaux de microélectrodes d'or sur la surface inférieure des puits, servant de capteurs cellulaires. L'affichage de l'impédance est modifiée par le nombre de cellules adhérentes, la viabilité des cellules, la morphologie, et l'adhérence. Un paramètre sans dimension appelé l'indice cellulaire est dérivé à partir des mesures d'impédance électrique et est utilisée pour représenter l'état de la cellule. Dans l'ensemble, le temps réel analyseur de cellules à base d'impédance permet en temps réel, l'évaluation sans étiquette de la neuroprotection et la neurotoxicité, et l'évaluation de la deuxième participation de voies de messagerie, contribuant à plusévaluation détaillée et à haut débit de composés neuroprotecteurs potentiels in vitro, pour la sélection des candidats thérapeutiques.
Introduction
La mort cellulaire neuronale joue un rôle critique dans la pathophysiologie de nombreux troubles liés au cerveau 1. La disponibilité d'informations fiables et à haut débit dans des tests de toxicité in vitro est essentiel d'avoir un meilleur aperçu des mécanismes de la neurotoxicité et d'aider à sélectionner des molécules neuroprotectrices comme candidats thérapeutiques dans le développement de médicaments 2. Cependant, il ya beaucoup de limitations à la plus largement utilisée in vitro neurotoxicité assays.They évaluer la neurotoxicité / neuroprotection à un seul point dans le temps ne permet pas la résolution cinétique; utilisent souvent l'étiquette ou de la sonde qui peut interférer avec les voies de signalisation et de limiter d'autres études dans la même population de cellules, et sont souvent de main-d'œuvre, et dans de nombreux cas ne fournit pas une approche mécanistique. Dans la présente étude, nous avons démontré l'utilité d'une cellule d'analyse en fonction de l'impédance en temps réel afin de déterminer la neurotoxicité et de neuroprotection dans une lignée cellulaire neuronale, en temps réel et sans marqueur sousconditions et permettent de mieux comprendre les mécanismes en aval à travers l'analyse de la seconde piste de messagerie impliqués dans l'effet.
Des études antérieures ont confirmé la validité de la cellule d'analyse en temps réel afin de déterminer la cytotoxicité, ainsi que les effets sur la prolifération cellulaire dans les lignées cellulaires par comparaison avec des techniques classiques 3,4,5,6. Par exemple, une bonne corrélation a été observée entre les lectures de la norme viabilité cellulaire WST-1 essai et cellulaires valeurs de l'indice à plusieurs points dans le temps dans des conditions de prolifération basale et après deux paradigmes différents toxiques dans les cellules HeLa 3. Dans A549 et MDA-MB-231 cellules prolifération et la cytotoxicité provoquée par le paclitaxel de stabilisation des microtubules ont montré des valeurs très similaires lors de l'évaluation par la mesure de l'indice cellulaire et la sulforhodamine utilisé en standard B (SRB) essai 4. Dans la lignée cellulaire neuronale de neurones de l'hippocampe immortalisés Index HT-22 cellulaires mesures ont été validés pour leur capacité to détecter la prolifération cellulaire, la cytotoxicité et la glutamate cytoprotection contre le 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl) largement utilisé du 2,5-diphényl-bromure (MTT) 5. Dans la même étude, les résultats d'analyse de MTT et les mesures de l'indice cellulaire aussi bien corrélées à la mesure neuronale des cellules progénitrices prolifération, cytotoxicité après les facteurs de croissance privation et de sauvetage de la cytotoxicité par le pan-caspase inhibiteur QVD 5. La cytotoxicité induite dans des cellules NIH 3T3 par Vandetanib (récepteur du facteur de croissance de l'endothélium vasculaire et d'un inhibiteur du récepteur du facteur de croissance épidermique) a montré des résultats similaires avec des valeurs mesurées de l'indice cellulaire ou neutre essai d'absorption rouge 6.
Récemment, nous avons utilisé le système d'analyse de cellules en temps réel pour évaluer les effets neuroprotecteurs de la figure 2A de la sérotonine (5-HT 2A) agoniste du récepteur de chlorhydrate de (±) -2,5-diméthoxy-4-iodoamphétamine (DOI) dans une lignée cellulaire neuronale ( cellules SK-N-SH) et criblés pour la participation du second voies de messagerie par le biais de la surveillance de l'effet de leur inhibition chimique sur la neuroprotection observée 7. Fait intéressant, le récepteur 5-HT 2A a agonistes fois hallucinogènes et nonhallucinogenic (comme DOI et lisuride, respectivement), ce qui peut activer les deux secondes voies de messagerie communs et distincts 8.
Les avantages de la technique présentée est qu'il permet de recueillir des informations en temps réel sur la survie des cellules au cours de jours, pour délimiter les voies de seconds messagers impliqués, afin d'évaluer la contribution possible des effets de prolifération à la neuroprotection, et pour sélectionner un temps optimal des études supplémentaires de point final sur la même population de cellules. Un diagramme schématique du flux de travail dans le protocole actuel est présenté sur la figure 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole actuel présente l'utilité d'une cellule d'analyse en temps réel pour évaluer de façon continue et dans des conditions sans étiquette / les effets neuroprotecteurs des composés neurotoxiques dans des lignées cellulaires neuronales et pour mieux comprendre les secondes voies de messagers impliqués dans l'effet.
Même si l'utilité du temps réel analyseur de cellules pour étudier la cytotoxicité et les effets des médicaments sur la prolifération ce…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Financial support for the experiments presented in the study was provided by the Marie Heim-Vögtlin program of the Swiss National Science Foundation.
We thank Ms. Johanna Nyffeler for developing a set of modified MATLAB programs for screening for statistically significant differences in real-time cell analyzer’s data and Dr. Yama Abassi for helpful discussion.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| xCELLigence RTCA SP system bundle | ACEA Biosciences | No: 00380601030 | consists of RTCA Analyzer, RTCA SP Station and RTCA Control Unit |
| E-plate 96 | ACEA Biosciences | No: 05232368001 | for culturing the cells, inserted in the RTCA SP Station |
| SK-N-SH cells | ATCC – (in partnership with LGC Standards) | HTB-11 | can be replaced by another adherent neuronal cell line of interest |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D8437 | cell culture medium |
| fetal bovine serum | Life Technologies | 16140-063 | supplements proliferation, but not serum deprivation medium |
| tisue culture flask T175 | Sarstedt | 83.1812.302 | for culturing cells, which will be later plated on the E-Plate 96 |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | for trypsinization of cells cultured in tissue culture flasks |
| Scepter 2.0 cell counter | Merck Millipore | PHCC20060 | automated cell counter |
| phosphate-buffered saline | Life Technologies | 10010-015 | for washing the cells |
| (±)-DOI hydrochloride | Sigma-Aldrich | D101 | 5-HT2A agonist for cell culture treatment |
| LY-294,002 hydrochloride | Sigma-Aldrich | L9908 | PI3-K inhibitor for cell culture treatment |
| lisuride maleate | Tocris Bioscience | 4052 | compound with 5-HT2A agonistic activity for cell culture treatment |
| dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D4540 | for dissolving LY-294,002 and lisuride maleate |
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