신경 세포주에 신경 독성과 신경에 관여하는 분자 진학의 윤곽을하는 도구로 실시간 임피던스 기반의 세포 분석기
Summary
Improved in vitro neurotoxicity assays would aid the identification of new neuroprotective compounds. The utility of a real-time impedance-based cell analyzer to determine cytotoxicity and cytoprotection in neuronal cell lines and to delineate the involvement of second messenger pathways, thus gaining insight in the mechanism of neuroprotection is presented.
Abstract
많은 뇌 관련 질환은 병태 생리에 관여하는 신경 세포의 죽음이있다. 약물과 신경 / 신경 독성의 분자 메커니즘에 대한 통찰력을 확보하고 잠재적으로 신약 개발을 촉진 할 수 있습니다 도움이 될 관련 다운 스트림 경로의 신경 또는 신경 독성 효과를 연구하기 위해 체외 모델에서 개선. 그러나, 기존의 많은 시험 관내 독성 분석법은 중요한 제한이 – 가장 안 시간 코스 및 효과의 동력학을 관찰 할 수 있도록, 하나의 시점에서 신경 보호 및 신경 독성을 평가한다. 또한, 실시간으로 신경 보호에 관여하는 신호 전달 경로 다운 스트림에 대한 정보를 수집 할 수있는 기회는 매우 중요하다. 현재의 프로토콜에서는 라벨없는 실시간 condit하에 신경 세포주에서 세로토닌 2A (5-HT의 2A) 수용체 작용제의 신경 보호 효과를 결정하기 위해 실시간 임피던스 기반 세포 분석기의 사용을 설명임피던스 측정을 이용하여 이온. 더욱이, 우리는 제 메신저 경로의 억제제는 신경 보호 효과에 관여하는 분자 스트림을 묘사하기 위해 사용될 수 있음을 보여준다. 우리는 또한 세포 증식에 영향이 관찰 된 신경 보호 효과에 기여 여부를 확인하려면이 기술의 유틸리티를 설명합니다. 시스템은, 웰의 바닥 표면에 금 미세 전극 배열을 교대 셀 센서로서 포함 E-플레이트라고도 특수 마이크로 플레이트를 이용한다. 임피던스 읽기가 부착 세포, 세포 생존, 형태, 및 접착 숫자로 변경된다. 셀 인덱스라는 무 차원 파라미터는 전기 임피던스 측정으로부터 도출되고, 상기 셀의 상태를 나타내는 데 사용된다. 전반적으로, 실시간 임피던스 기반 세포 분석기는 더 기여 실시간, 신경 보호 및 신경 독성의 라벨없는 평가, 및 제 메신저 경로 개입의 평가를 허용치료 후보를 선택하기위한 시험 관내에서 잠재 신경 화합물의 상세하고 높은 처리량 평가.
Introduction
신경 세포의 사멸이 많은 뇌 관련 질환의 병태 생리 1에서 중요한 역할을한다. 체외 독성 분석의 신뢰성 및 높은 처리량의 가용성은 신경 독성의 메커니즘에 대한 통찰력을 얻기 위해 약물 개발이의 치료 후보로 신경 분자를 선택하기 위해 매우 중요합니다. 그러나 가장 널리 운동 해상도를 허용하지 않는 하나의 시간 시점에서 신경 독성 / 신경을 평가 체외 신경 독성 assays.They 사용에 많은 제한이있다; 종종 신호 전달 경로를 방해하고 같은 세포 집단에서 추가 연구를 제한하고, 종종 노동 집약적이며, 많은 경우에 기계적인 통찰력을 제공하지 않습니다 수 있습니다 라벨 또는 프로브를 사용합니다. 본 연구에서 우리는 실시간 미만 신경 세포주에서 세포 독성 및 신경 보호를 결정하기 위해 실시간 임피던스 기반 세포 분석기의 유용성을 증명 라벨없는조건 효과에 관련된 제 메신저 경로의 분석을 통해 하류 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하고.
이전의 연구는 표준 기법 3,4,5,6 비해 세포 독성은 물론 세포주에서 세포 증식에 미치는 영향을 결정하기 위해 실시간 세포 분석의 유효성을 확인했다. 예를 들어, 상관 관계는 기저 증식 조건 및 HeLa 세포에서 3 개의 다른 독성 패러다임 후 여러 시점에서 표준 세포 생존 WST-1 분석의 판독 및 셀 인덱스 값 사이에서 관찰되었다. 셀 지수 측정에 의해 평가하고 표준 적 사용 sulforhodamine의 B (SRB) 분석 4시 미세 소관 안정 파클리탁셀과 자극 A549 및 MDA-MB-231 세포의 증식과 세포 독성은 매우 유사한 값을 나타내었다. 불후의 해마 신경 세포의 신경 세포 라인에서 HT-22 세포 지수 측정은 자신의 능력 t에 대해 검증 하였다O 널리 사용되는 3 – (4,5 – 디메틸 -2 – 일)에 대해 세포 증식, 글루타메이트 독성 세포 보호 및 2,5 – 디 페닐 테트라 졸륨 브로마이드 (MTT) 분석 (5)를 검출한다. 같은 연구에서, MTT 분석 결과 및 셀 인덱스 측정은 또한 팬 카스파 제 억제제 QVD (5)에 의해 성장 인자 결핍 및 세포 독성의 복구 후 신경 전구 세포의 증식, 세포 독성을 측정하는 상관 관계. Vandetanib (혈관 내피 성장 인자 수용체 및 표피 성장 인자 수용체 억제제)으로 NIH 3T3 세포에서 유도 된 세포 독성 세포 인덱스 값 또는 중성 적색 흡수 분석법 (6)로 측정 유사한 결과를 보였다.
우리가 최근 세로토닌 2A의 신경 보호 효과를 평가하기 위해 실시간 세포 분석 시스템을 사용 하였다 (5-HT 2A) 수용체 작용제, (±) -2,5 – 디메 톡시 4 – iodoamphetamine 염산염 신경 세포주 (DOI) ( SK-N-SH 세포)와 세코의 참여에 대한 검사관찰 된 신경 보호 (7) 상에 화학적 억제의 효과를 모니터링을 통해 차 메신저 경로. 흥미롭게도, 5-HT의 2A 수용체는 일반적으로 별개의 두번째 메신저 경로 팔 모두를 활성화시킬 수있다 (DOI 및 lisuride 각각 같은) 환각 및 nonhallucinogenic 모두 효능을 가지고 있습니다.
제시된 기술의 이점은, 일의 과정에서 세포 생존에 대한 정보를 실시간으로 수집하는 신경에 대한 증식 효과 가능한 공헌을 평가하고 최적 시간을 선택하는 제 메신저 경로가 관여 묘사 할 수 있다는 점이다 같은 세포 집단에 대한 자세한 엔드 포인트의 연구. 현재 프로토콜의 워크 플로우의 개략도는 그림 1에 제시되어있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
현재 프로토콜은 연속적 및 라벨없는 조건에서 신경 세포주에서 화합물의 신경 / 신경 독성 효과를 평가하기 위해 상기 효과에 관련된 제 메신저 경로에 대한 통찰력을 얻기 위해 실시간 셀 분석기의 유틸리티를 제공한다.
세포 독성 및 세포 증식에 대한 약물의 효과를 연구하기 위해 실시간 셀 분석기 효용은 일반적으로 인식 되더라도, 단지 몇 연구는 신경 관련 세포 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Financial support for the experiments presented in the study was provided by the Marie Heim-Vögtlin program of the Swiss National Science Foundation.
We thank Ms. Johanna Nyffeler for developing a set of modified MATLAB programs for screening for statistically significant differences in real-time cell analyzer’s data and Dr. Yama Abassi for helpful discussion.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| xCELLigence RTCA SP system bundle | ACEA Biosciences | No: 00380601030 | consists of RTCA Analyzer, RTCA SP Station and RTCA Control Unit |
| E-plate 96 | ACEA Biosciences | No: 05232368001 | for culturing the cells, inserted in the RTCA SP Station |
| SK-N-SH cells | ATCC – (in partnership with LGC Standards) | HTB-11 | can be replaced by another adherent neuronal cell line of interest |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D8437 | cell culture medium |
| fetal bovine serum | Life Technologies | 16140-063 | supplements proliferation, but not serum deprivation medium |
| tisue culture flask T175 | Sarstedt | 83.1812.302 | for culturing cells, which will be later plated on the E-Plate 96 |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | for trypsinization of cells cultured in tissue culture flasks |
| Scepter 2.0 cell counter | Merck Millipore | PHCC20060 | automated cell counter |
| phosphate-buffered saline | Life Technologies | 10010-015 | for washing the cells |
| (±)-DOI hydrochloride | Sigma-Aldrich | D101 | 5-HT2A agonist for cell culture treatment |
| LY-294,002 hydrochloride | Sigma-Aldrich | L9908 | PI3-K inhibitor for cell culture treatment |
| lisuride maleate | Tocris Bioscience | 4052 | compound with 5-HT2A agonistic activity for cell culture treatment |
| dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D4540 | for dissolving LY-294,002 and lisuride maleate |
References
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