Jsubtomoを用いた電子Cryotomography再建からのウイルスのエンベロープ糖タンパク質スパイクの平均化

計算上のアライメントおよびウイルス糖タンパク質スパイクのその後の平均化のための詳細なプロトコルが概説されている。プロトコルは、 図1に示したワークフローに従っており、初期テンプレート構造を使用してスパイクとゴールドスタンダード構造精密化のための自動検索を兼ね備えています。 このプロトコルの入力データは、ビリオンの断層再構成のセットです。一つの断層は、1つまたはそれ以上のビリオンを含んでいます。最初に、スパイクの小さなサブセットを手動で採取し、二つの独立したモデルを平均化し、リファインするために使用される。これらのモデルは、自動的にビリオンのすべてのスパイクを検索するために使用されている。最後に、2つの独立した改良が実行され、得られた平均値を比較し、最終的な構造を生成するために結合される。 精密化アプローチはJsubtomoパッケージからのプログラムを使用することによって実証される。 Bsoftパッケージ28からのプログラムは、一般的な画像pのために使用されているrocessingタスクおよび分子グラフィックスパッケージUCSFキメラ29は、結果を視覚化するために使用される。イタリックやファイル形式で与えられる各プログラムの名前が大文字のファイル名の拡張子を付している。 図1：多形性メンブレンウイルスからスパイクの複合体糖タンパク質の構造を決定するための一般的な戦略の数字はプロトコルの異なるセクションに対応するこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 1フルサイズの断層像からウイルスサブボリュームの抽出断層像で手動でウイルス粒子を選択してください。 と（b）における断層像ファイルを開きます。ウイルスの粒子フィルタの中心座標を定義します。ルは、粒子ピッキングツールを使用して。すべてのビリオンが処理されるまで、この手順を繰り返します。スターファイルでウイルスの座標を保存します。 全ての断層像が処理されるまでステップ1.1.1を繰り返す。ピクセル単位でビリオン直径をメモしておきます。 注：スパイクは、断層像に見えにくい80オングストロームの分解能にローパスフィルタへの断層像をbfilterを使用します（パラメータ"-bandpass 80,10000」）である場合。 個別のボリューム·ファイルにビリオンサブボリュームを抽出するための抽出モード（パラメータ"–mode抽出物」）にjsubtomo.py実行します。入力ファイルとしてステップ1.1.1で保存されたSTARファイルを使用します。 データセット内の最大ビリオンよりも25％大きいサイズ（パラメータが「–size」）〜を与えます。 たとえば 、ビリオンは直径〜200ピクセル、使用サイズ250×250×250ピクセルである場合。 ビリオンボリュームの出力ファイルは、MAP-形式になります。加えて、各ビリオンボリュームの付随STAR-ファイルを作成します（パラメター "–output」）。 BIMG（パラメータ"-rescale 0,1"）でビリオンボリュームを正規化します。 二つの独立した初期のモデルの2世代ビリオンサブボリューム内のスパイクのサブセットを選択してください。 と（b）におけるビリオンサブボリュームMAPファイルを開きます。 [ツールボックス]ウィンドウを介してアクセス可能な粒子ピッキングツールを使用して、スパイクの中心座標を定義します。すべての明らかに異なるスパイクが処理されるまで、この手順を繰り返します。保存スパイクはSTARファイルで調整します。 必要に応じて、約200の糖タンパク質スパイクが処理されるまで、他のビリオンのためのステップ2.1.1を繰り返します。ピクセル単位でのスパイクの大きさに注意してください。 注：〜200スパイクは目安であり、よりいくつかのアプリケーションが必要な場合があります。可能であれば、異なる向きにスパイクを選ぶことを目指しています。トップのみのビューを選ぶことは避けてください。 jviews.pを実行して、スパイクへの最初の視線ベクトルを割り当てyを。入力ファイルとしてステップ2.1.1で生成されたSTARファイルを使用します。 注：このビューベクトルは、ビリオンを参照して、スパイクの方向を近似する。 中央が球状ビリオンのビューを割り当てることがコーディネートに使用します。ビリオンは250×250×250ピクセルの大きさのボックスに（ステップ1.2の後）、中央に配置された場合、中心座標が125125125ピクセル（オプション "–Radial 125125125」）である。 糸状ビリオンのためのビューを割り当てるには、入力ファイルとしてステップ2.1.1で定義されたSTARファイルを使用して、 と（b）の各ビリオンサブボリュームを開きます。フィラメントピッキングツールを使用して、フィラメントの両端点を定義し、STARファイルを保存します。オールスターのファイルが更新されるまで、この手順を繰り返して、入力ファイル（–optionセグメント）のように更新STARファイルを使用してjviews.py実行します。 jsubtomo_create_mask.pyを使用して実空間マスクを生成します。実空間マスクは同じdimensであることを確認してください平均化された構造のために使用されるように、イオンは、（2.6.2を参照）、スパイクと下地膜のパッチの両方を含むのに十分な大きさである。 jsubtomo_create_wedgemask.pyを使用して逆空間マスクを生成します。逆空間マスクは、単一の軸断層撮影データ収集から得られる「欠落ウェッジ '領域内の領域を除外するために使用される。 （2.6.2を参照）を平均構造のために使用されるように、同じ寸法のものであることを確認してください。 jsubtomo_evenodd.pyステップ2.2で生成されたSTARファイルを使用して「1」と「2」のセットに属するウイルス粒子を定義する選択ファイル（SELファイル）を生成する。 jsubtomo_create_averages.pyを使用した2つの初期の平均値を生成します。 入力ファイルとしてステップ2.5で生成されたSELファイルを使用します。 サイズを与える（パラメータが「–size」）スパイクの最大寸法よりも大きく、少なくとも32ピクセル。 たとえば 、スパイク〜40ピクセルに長い場合、サイズは72×72×72ピクセルを使用しています。 スパイクの長軸周りの円筒形の平均に近づけるために、高い平均値を上の対称性（ 例えば 、C100）（パラメータ「–symmetryのC100」）を適用します。初期の平均値にノイズを低減するために対称化を使用してください。 プロジェクト（パラメータ "–suffix」）の出力ファイルの一意の名前を指定します。 背景（パラメータ "–mask」）を離れてマスクするステップ2.3で生成された実空間マスクを使用してください。不足しているウェッジ（パラメータ "–mask」）の存在によって導入された信号の損失を考慮するためのステップ2.4​​で生成された逆空間マスクを使用してください。 3ゴールドスタンダード反復アライメントと2つの初期スパイクモデルの平均化反復的に整列し、jsubtomo_iterate_gold.pyのセクション2で生成された2つの初期のモデルを平均。 ステージIで、この段階の目標は、洗練することです視線ベクトルの方向。入力ファイルは、ステップ2.5で生成されたSELファイルです。 8度の角度サンプリング（パラメータ "–angles 8,8,8」）を使用してください。 （パラメータ「16 –thetaphilimit」）スパイク視線ベクトルの方向に16度の変更は許可するが、スパイクの長軸に固定（パラメータ「–alphalimit 0 "）周りの角度を保持します。 （パラメータが「5 –shiftlimit」）スパイクのマニュアルピッキングの不正確さを考慮して、小型のトランスレーショナルシフト（ 例えば 5画素）を許可します。 スパイクの長軸周りの円筒形の平均に近づけるために、高い平均値を上の対称性（ 例えば 、C100）（パラメータ「–symmetryのC100」）を適用します。 注：対称化は、平均値のノイズを減少させるために使用される。 不足しているウェッジ（パラメータ "–mのために周囲のスパイクやアカウントを離れてマスクする実空間マスクとステップ2.3および2.4で発生する逆空間マスクを使用して、）は、それぞれ、「–mask尋ねる」や「。 2.6で生成された2マップファイルを使用します（「偶数」のタグで示されると、ファイル名に「奇数」）（それぞれ、パラメータ「–Template1」と「–Template2」）をテンプレートとして。 アライメント偏りを防ぐために、50オングストロームの分解能（パラメータ "–resolution」）にローパスフィルタを適用します。 洗練（「2 –bin」パラメータ）をスピードアップするために2のビン係数を適用します。 アライメントと平均の5回の繰り返し（ "1 –lastiter 5 –firstiter"パラメータ）を実行します。 ステージII。この段階の目標は、視線ベクトル周りの角度を調整することです。入力ファイルは、ステップ3.1.9からの出力SELファイルである。 と（b）で（ファイル名にタグ「_lp」と表記）は、ステップ3.1.9の最後の反復で生成された低域通過フィルタ処理MAPファイルを開くことによって、スパイクの正確な寸法を測定します。新たな実を生成空間マスクは、同様にスパイクを定義するが、膜と隣接するスパイクの大半を除外2.3に進む。 注：マスクの最適サイズは、スパイクの大きさや機能に依存します。 8度の角度サンプリング（パラメータ "–angles 8,8,8」）は、以前のように使用してください。 スパイクビューベクトル（ " – alphalimit 180"パラメータ）を中心角で180度の変更を可能にするが、シータを保つとphi角度が固定された（パラメータが "0 –thetaphilimit」）。 いずれの並進シフト（パラメータが「0 –shiftlimit」）を許可しないでください。 の平均値（パラメータ "–symmetry"は省略）上の任意の対称性を与えたりしないでください。 不足しているウェッジを考慮するためのステップ2.4​​で生成された逆空間マスクを使用してください。 対称性のないステップ3.1.9の最後の反復で生成された2マップファイルを使用したテンプレート（パラメータRと（タグ、ファイル名に「even_nosym」と「odd_nosym」と表記）20; – それぞれTemplate1を」と「–Template2」）。 アライメント偏りを防ぐために、最初の反復で、50オングストロームの分解能（パラメータ "–resolution」）にローパスフィルタを適用します。二つの独立した平均値のゴールドスタンダードフーリエシェル相関（FSC）に基づいて自動的に後続の反復におけるフィルタパラメータ（パラメータ "–adaptivefilter」）を調整します。 0.143-基準（パラメータ "–fsccrit 0.143"）を使用してください。 CTF補正が断層像に適用されていない限り、コントラスト伝達関数（CTF）（パラメータ "–minhires」）の最初のゼロを越えて洗練させないでください。 （ 例えば 、パラメータ「6 –lastiter 15 –firstiter」）アラインメントの5-10回の反復を実行し、平均する。報告された解像度の変化を監視します。有意な変化は観察されない場合、処理は停止することができる。 examiniによって構造に対称性の程度を評価スパイクが三量体複合体である場合には、 キメラ 。 例：中（ファイル名でタグ「_lp」と表記）を得られた低域通過フィルタ処理MAPファイルngを、3回対称性は明らかである。 ステージIII。この段階の目標は、正しい対称性をさらに視線ベクトル周りの角度を調整することです。入力ファイルは、ステップ3.2.9からの出力SELファイルである。パラメータは、いくつかの例外を除いてステップ3.2と同じです。 スパイク視線ベクトル周りの角度を適切に変更を許可します。例えば、構造が3回対称性を有する場合に、（パラメータ「60 –alphalimit」）、α角60度の変化を可能にする。 平均化する（パラメータ–symmetry c3を」）の正しい対称性（ 例えば 、C3）を適用します。 入力されたテンプレートファイル（パラメータ「–Template1」と、ステップ3.2.9（ファイル名に「偶数」タグで示され、「奇数」）の最後の反復で生成された2マップファイルを使用してください –Template2）。 （ 例えば 、パラメータ「16 –lastiter 25 –firstiter」）アラインメントの5-10回の反復を実行し、平均する。報告された解像度の変化を監視します。有意な変化は観察されない場合、処理は停止することができる。 IV期。この段階の目標は、正確に同時に3つのすべての角度を調整することです。入力ファイルは、ステップ3.4.4からの出力SELファイルです。パラメータは、いくつかの例外を除いてステップ3.4の場合と同様である。 スパイクビューベクトル（ " – alphalimit 8"パラメータ）周りの角度は8度の変更を許可するとスパイク視線ベクトルの方向に8度の変化（パラメータが「8 –thetaphilimit」）。 4度の精度（パラメータ "–angles 8,8,8 –iterate 2」）に向きを絞り込む。 （パラメータが「5 –shiftlimit」）小さな変化（ 例えば 、5画素）前の位置合わせの手順の不正確さを考慮することを許可する。 Uステップ3.4.4の最後の反復で生成された2 MAPファイル（「偶数」のタグで示されると、ファイル名に「奇数 "）入力テンプレートファイル（パラメータ「–Template1」と–Template2）などのSE。 （ 例えば 、パラメータ「26 –lastiter 35 –firstiter」）アラインメントの5-10回の反復を実行し、平均する。報告された解像度の変化を監視します。有意な変化は観察されない場合、処理は停止することができる。 テンプレートマッチングのためのウイルス表面への種子の4世代とアライメントテンプレートマッチングのためのビリオン表面上に均等に配置さの種を生成し、jviews.pyを実行することにより、種子への初期ビューベクトルを割り当てる。入力ファイルとしてステップ1.2.2で生成されたSTARファイルを使用します。スパイクの予想される数よりも約1.5倍の種を生成します。 注：このビューベクトルは各シード点に最も近いスパイクの方向を近似する。種子の、ほぼ球形のビリオン（パラメータ"–Even」）上に均一に分布した種子を生成する半径を（パラメータ" –radius」）を与えるために、分離角（ 例えば 20度） "20 –angle"（パラメータ）と中央がビリオンの座標。 たとえば 、ビリオンは250×250×250ピクセルの大きさのボックスのステップ1.2）の後に（中央に配置されている場合、中央の座標）が「125125125 –origin "125125125ピクセル（オプションです。 繊維状粒子上に均一に分布し、種子を生成するには、「–Filament "パラメータを使用して、半径ヘリカル対称性パラメータ（上昇とツイスト）の両方を指定します。 注：ヘリカル対称パラメータは、均等に分布し、シード位置を定義する便利な方法として、ここで使用され、それらは、フィラメント上のスパイクの実際の順序付けを反映する必要はありません。 explaineなどのウイルス表面の二つの独立した平均値を生成するセクション2中のd。 jsubtomo_evenodd.pyステップ4.1で生成されたSTARファイルを使用して「1」と「2」のセットに属するウイルス粒子を定義するSELファイルを生成する。 注：グループに、ビリオンの以前の割り当てをデータセットの独立性を確保するために「1」と「2」は、同じ滞在する必要があります。 種子の位置を絞り込む。 特に明記しない限り、ステップ3.1の指示に従ってください。入力ファイルとしてステップ4.2.1で生成されたSELファイルを使用します。 種子がメンブレン（パラメータ "–zshiftlimit」）にのみ正常に沿ってシフトすることを許可します。ビリオンは理想球面ジオメトリから外れるどの程度に応じて、シフトの許容量を調整します（ 例えば 、パラメータが「25 –zshiftlimit）。 ステップ4.2で生成された2のMAPファイルを使用–Tem「入力テンプレートファイル（パラメータとして（「偶数」タグと、ファイル名に「奇数」と表記）板1 "と–Template2）。 （ 例えば 、パラメータ"–suffix _seeds」）元の入力STARのファイルが上書きされないように、一意のサフィックスを使用してください。 計算（「4 –bin」パラメータ）とローパスフィルタをスピードアップするために4のビニングを使用する（ 例えば 、パラメータ「–resolution 50」）。 jviews.py（パラメータ"–cmm」）を使用して洗練されたシードSTARファイルのキメラマーカーファイル（CMM）は生成します。 キメラでCMMファイル（および関連するビリオンのMAPファイル）を開くことによって、種子を調べます。洗練された種子が正しくウイルス膜と比較して整列していることを確認してください。 注：別の色はマーカーの別個のセット（パラメータ "–color」）を区別するために使用することができます。代替的に洗練されたマーカーは、それらの相互相関係数（ 例えば 、パラメータ「–fomcolor 0.1,0.3」）に基づいて着色することができる。 5。ゴールドスタンドARD反復アライメントやスパイク構造の平均化自動的に洗練された種子の周りにローカルテンプレートマッチングを用いてビリオンサブボリューム内のすべてのスパイクを見つけて位置してスパイクを合わせ、平均する。初期テンプレートとして手動で拾っスパイクのサブセットから生成された平均値を使用してください。 プログラムjsubtomo_iterate_gold.pyを使用して、すべてのスパイクを平均化するために、種子の周りに地元のテンプレートマッチングを実行します。特に明記しない限り、ステップ3.5の指示に従ってください。 入力ファイルは、ステップ4.3で生成された洗練された種子のSELファイルです。 視線ベクトル角について十分に大きな制限を使用します。 例えば、種子が20度ごと（ステップ4.1）が発生した場合には、（パラメータが「12 –thetaphilimit」）は、この値の半分よりわずかに大きい角度を使用しています。スパイク視線ベクトル周りの角度を適切に変更を許可します。 （パラメータの種が膜の平面にシフトすることを許可する「–xyshiftlimit」）。 たとえば 、種子から種子の距離が25ピクセルである場合に、これの半分よりわずかに合計シフト（ 例えばを使用し、パラメータ）が「6 –xyshiflimit 10 –shiftlimit」。 注：ステップ3.5で生成されたMAPファイルは、種子よりビリオン中心から異なる距離を中心としている場合は、追加の並進シフトが必要になることがあります。 ステップ3.5で生成された2マップファイルを使用します（「偶数」のタグで示されると、ファイル名に「奇数 "）入力テンプレートファイル（パラメータ「–Template1」と–Template2）など。 ステップ3.5（パラメータ–resolution）で生成されたマップ·ファイルの現在の解像度を使用してください。 テンプレートマッチング、アライメントと平均の5〜10回の繰り返し（ "1 –lastiter 10 –firstiter」 などのパラメータ）を実行します。報告された解像度の変化を監視します。有意な変化は観察されない場合、処理は停止することができる。 各繰り返しの後重複ヒットが除外されています。 たとえば 、スパイクの幅が30ピクセルであれば、他のヒット（パラメータ"–mindist 30"）に30ピクセルよりも近いヒットを除外する。 共同効率的な低相互相関を持つヒットを除外します。たとえば、各ビリオン（パラメータ "–topp 75」）のための最高の75％のスパイクが含まれています。 注：低い相互相関の共同効率的で安打偽陽性ヒットを表す可能性が高い。 結果の可視化6。 可視化のためのキメラにスパイクの洗練された構造を開き、原子構造のフィッティング。 入力ファイルとしてステップ5.1.6で最後の繰り返しで作成された（タグ「LP」と表記）は、低域通過フィルタ処理MAPファイルを使用します。 ツール「Mapに合わせる」 キメラで相互相関ベースのフィッティングのためのステップ5.1.6に示された解像度を使用してください。 virioの複合モデルを作成します。nはjsubtomo_create_model.py使って。 入力MAPファイルとしてステップ5.1.6で最後の繰り返しで作成された（タグ「LP」と表記）は、低域通過フィルタ処理MAPファイルを使用します（パラメータ "–template」）。 入力STARのファイルとしてステップ5.1.6で最後の反復で生成されたSTARファイルを使用します。 複合モデル（パラメータ "–mask"）で密度の重複を考慮して、ステップ3.2.1で生成されたマスクファイルを使用します。 同じサイズの複合モデル（パラメータ "–size」）を生成するためにビリオンMAPファイルのサイズを指定します。 キメラで可視化のための複合モデルを開きます。