Della media di Viral Busta Glicoproteina Spikes da Electron Cryotomography Ricostruzioni con Jsubtomo
Summary
An approach is presented for determining structures of viral membrane glycoprotein complexes using a combination of electron cryo-tomography and sub-tomogram averaging with the computational package Jsubtomo.
Abstract
Virus con involucro utilizzano glicoproteine di membrana sulla superficie di mediare l'ingresso nelle cellule ospiti. Tridimensionale analisi strutturale di queste glicoproteina 'punte' è spesso tecnicamente impegnativo, ma importante per comprendere la patogenesi virale e nella progettazione di farmaci. Qui, un protocollo viene presentato per la determinazione della struttura virale picco attraverso media computazionale di elettroni dati crio-tomografia. Electron crio-tomografia è una tecnica di microscopia elettronica utilizzata per ricavare tridimensionali ricostruzioni tomografiche di volume, o tomografie, di campioni biologici pleomorfi come virus membrana in uno stato congelato-idratato quasi native. Queste tomografie rivelano strutture di interesse in tre dimensioni, anche se a bassa risoluzione. Media computazionale dei sotto-volumi, o sub-tomografie, è necessario per ottenere maggiore dettaglio la risoluzione di ripetere motivi strutturali, come ad esempio i picchi glicoproteina virale. Un approccio computazionale dettagliato per aligning e media sub-tomogrammi utilizzando il pacchetto software Jsubtomo è delineato. Questo approccio consente la visualizzazione della struttura di picchi glicoproteine virali di risoluzione nell'intervallo 20-40 Å e studio dello studio di ordine superiore picco-a-picco interazioni sulla membrana virione. I risultati tipici sono presentati per Bunyamwera virus, un virus con involucro della famiglia Bunyaviridae. Questa famiglia è un gruppo strutturalmente eterogeneo di agenti patogeni che costituiscono una minaccia per la salute umana e animale.
Introduction
Electron crio-tomografia è una tecnica di imaging elettronico crio-microscopia che permette il calcolo di una tridimensionale (3D) ricostruzione di campioni biologici complessi. I campioni idonei vanno da complessi macromolecolari purificate 1, 2 filamenti, vescicole rivestite 3, e virus membrana pleomorfi 4 a intere cellule procariote 5 e anche le aree sottili di intere cellule eucariotiche 6. Dopo la raccolta dei dati di un tilt-serie, volumi tomografiche 3D, o tomografie, può essere calcolato utilizzando diversi pacchetti software affermati, tra cui Bsoft 7 e IMOD 8.
Due aspetti inerenti allo studio di campioni biologici dal limite elettroni tomografia crio-l'interpretazione biologica dei corrispondenti volumi tomografiche. In primo luogo, a causa della dose di elettroni limitata che può essere applicato a materiali biologici prima di introdurre significativi danni da radiazioni, signaL-to-noise ratio nei dati tomografici sono in genere molto bassi. In secondo luogo, a causa della geometria del campione limitato inclinazione durante la raccolta dei dati, alcune viste dell'oggetto rimangono assenti, portando ad un cosiddetto artefatto 'cuneo mancante' nel volume tomografica. Tuttavia, entrambi questi limiti possono essere superati se il volume tomografica contiene ripetendo strutture identiche, come i complessi macromolecolari, che possono essere correttamente mediate 9-12.
Prima di una media struttura di ricostruzioni tomogramma, oggetti di interesse devono essere trovate e allineati allo stesso orientamento. Individuazione tali strutture può essere raggiunto mediante cross-correlazione di una struttura modello nel volume tomografica utilizzando un approccio spesso indicato come modello di corrispondenza 13. Il modello utilizzato in questo processo di corrispondenza può essere derivata da elettroni crio-microscopia elettronica o crio-tomografia combinata con ricostruzione 3D, oppure può essere una mappa di densità simulato dauna struttura atomica. Alcuni pacchetti computazionali sono stati sviluppati per svolgere questi compiti 11.
Della media dei picchi glicoproteina di membrana di virus, come l'HIV-1, è stato un approccio particolarmente efficace per studiare la loro struttura 14-16. La comprensione della struttura è integrale per rivelare sia le basi molecolari delle interazioni virus-ospite e guidare lo sviluppo di design antivirali e di vaccini. Mentre la cristallografia macromolecolare è la tecnica di scelta per alta risoluzione (generalmente migliore di 4 Å) analisi strutturale delle singole glicoproteine virali e loro complessi, le strutture raggi X risultanti da tale metodo di proteine isolate dall'ambiente membranosa naturale sul virione . Così, dettagli importanti come l'architettura ordine superiore di glicoproteine virali, nel contesto del virione, rimangono privi. D'altra parte, elettrone crio-microscopia e singola particella ricostruzionedi intere virus con involucro è limitato a virioni con simmetria icosaedrica 17,18. Electron cryotomography combinato con l'allineamento sub-volume è dunque emerso come tecnica complementare che permette lo studio dei picchi glicoproteina di forma irregolare, virus pleomorphic in situ.
Abbiamo sviluppato un software chiamato Jsubtomo (www.opic.ox.ac.uk/jsubtomo) per la rilevazione, l'allineamento e la media dei tomografiche sotto-volumi. Jsubtomo è stato utilizzato nella determinazione della struttura di un certo numero di strutture cellulari e virali 19-26. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato, che permette alle strutture di picco virale di superficie determinazione. Per aggirare over-raffinamento di strutture mediati correlando rumore, il regime di perfezionamento 'gold standard' è adottato 10,27. Infine, le strategie per la visualizzazione e l'interpretazione dei risultati tipici sono discussi.
Protocol
Representative Results
Discussion
La conoscenza della struttura glicoproteina virale punta sulla membrana virione è essenziale per comprendere la replicazione del virus e lo sviluppo di terapie per trattare e prevenire le infezioni. Electron crio-microscopia combinata con un'unica media delle particelle è emerso come il metodo più utilizzato per risolvere le strutture di particelle del virus con involucro, comprese le punte glicoproteina. Tuttavia, questo metodo è limitato a icosahedrally virus simmetrici. Qui, attraverso l'applicazione di elettroni tomografia crio-e subtomogram media in Jsubtomo, abbiamo delineato un protocollo generale per determinare picchi glicoproteina su pleomorfo avvolto virus che non sono suscettibili di altre correnti metodi di biologia strutturale. I nostri risultati rappresentativi dimostrano che la risoluzione di questo metodo è sufficiente a rivelare intuizioni architettura di dominio, oligomerizzazione, e l'organizzazione di ordine superiore di punte glicoproteina su virioni intatti.
jove_content "> La fase più critica all'interno di questo protocollo sta costruendo due modelli di partenza affidabili che sono statisticamente indipendenti gli uni dagli altri. esecuzione di questa operazione presuppone che picchi glicoproteina sono sufficientemente grandi e non ammassata contro l'altro troppo stretto, in modo che i singoli picchi può essere riconosciute visivamente e manualmente raccolte nel tomogrammi, e due modelli indipendenti media. Se ciò non è fattibile, due modifiche al protocollo possono essere tentate. Innanzitutto, due modelli casuali indipendenti possono essere costruiti in primo luogo la definizione di due sottoinsiemi casuali di subtomograms e poi media dei subtomograms all'interno di questi sottoinsiemi 30. secondo luogo, se una struttura del picco isolato è stato ricavato con altri mezzi, ad esempio cristallografia a raggi X, può essere utilizzato come modello di partenza. Tuttavia, la cura deve essere presa per bassa filtro passa questo modello utilizzando un cut-off a bassa risoluzione (50-70 Å), come i due modelli risultanti nel prossimo turno di raffinatezza volontàessere statisticamente indipendenti solo oltre questa risoluzione. A causa di questo avvertimento, si raccomanda il primo approccio.La risoluzione ottenibile da questo protocollo dipende da quattro fattori principali: i. strategia di raccolta dei dati e la qualità dei dati in ingresso, ii. numero di subtomograms, iii. precisione di allineamento dei subtomograms, e iv. eterogeneità delle strutture. Mentre il primo e il secondo limite può essere ampiamente superato utilizzando rivelatori elevati segnale-rumore scalo elettroni combinati con CTF corretto tomografia e raccolta dati automatizzata, la precisione di allineamento è ulteriormente influenzata dalla dimensione e la forma della struttura di interesse stesso. Quando si applica questo protocollo sulle piccole punte prive di caratteristiche di spicco, può essere vantaggioso per legare i frammenti Fab per il picco di migliorare la precisione di allineamento e, quindi, la risoluzione 31. Infine, se le strutture siano in media presentano molteplici conformazioni, sub-TomogrMetodi di classificazione am possono essere utilizzati a media differenti conformazioni separatamente. A tal fine, Jsubtomo si integra con il pacchetto Dynamo, offrendo classificazione potente subtomogram 9.
Il protocollo di cui sopra è complementare alla cristallografia a raggi X di glicoproteine virali isolati. Strutture cristallografiche possono essere inseriti nelle medie sub-tomogramma per ottenere l'orientamento preciso della glicoproteina rispetto alla membrana virione. L'applicazione di questa metodologia sarà senza dubbio continuerà a far luce sulla struttura del virus avvolto e patobiologia.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Academy of Finland (130750 and 218080 to J.T.H.), the Wellcome Trust (090532/Z/09/Z; 089026/Z/09/Z to T.A.B.), and by the MRC (MR/J007897/1 to J.T.H and T.A.B; MR/L009528/1 to T.A.B.).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Jsubtomo (ver 1.3.1) | University of Oxford | n/a | www.opic.ac.uk/jsubtomo |
| Bsoft (ver 1.8.7) | NIAMS, NIH | n/a | bsoft.ws |
| UCSF Chimera | UCSF | n/a | www.cgl.ucsf.edu/chimera |
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